ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T31789—2015 冬生疫霉菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofPhytophthorahibernalisCarne 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:杜洪忠、吴品珊、王宏毅、严进、张秋娥。 ⅠGB/T31789—2015 冬生疫霉菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了冬生疫霉菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于针对冬生疫霉菌寄主的苗木、枝条、枝叶、果实以及夹带土壤和介质中冬生疫霉菌的 鉴定。 2 仪器和用具 2.1 仪器 生物显微镜、超净工作台、光照培养箱、电子天平(1/1000g)、高压灭菌锅、冰箱、PCR扩增仪、荧光 PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪、高速冷冻离心机、恒温水浴锅。 2.2 用具 烧杯、三角瓶、量筒、试管、培养皿、酒精灯、镊子、剪刀、解剖刀、接种针、载玻片、盖玻片、塑料研杵、 移液器、移液器吸头、离心管、液氮罐。 3 试剂、材料和培养基 3.1 试剂 匹马霉素(pimaricin),氨苄青霉素钠盐(ampicillin),利福平钠盐(rifampicin),五氯硝基苯(penta- chloronitrobenzene),碳酸钙(CaCO3),β-谷甾醇(β-sitosterol),色氨酸(tryptophan),硫氨(thiamine), 氯化钙(CaCl2·H2O),次氯酸钠(NaClO)。 琼脂糖,Tris-HCl,MgCl2,HCl,EDTA(乙二胺四乙酸四钠盐),NaOH,NaOAc,KCl,Tris,CTAB (十六烷基三甲基溴化铵),TAE,无水乙醇(Ethanol),三氯甲烷(Chloroform),异丙醇(Isopropanol),异 戊醇(Isoamylalcohol),SYBRGreenI核酸染料,蛋白酶K,TaqDNA聚合酶,dNTPs,DNA相对分子 质量标准物,PCR引物PHIB1和PHIB2,实时荧光PCR引物PH-F和PH-R及TaqMan-MGB探针 PH-Pr。 3.2 材料 琼脂粉、V8汁、雪松松针(Cedrusdeodara)、柑橘叶片(Citrusspp.)、胡萝卜、玉米油。 3.3 培养基 V8培养基、胡萝卜丝培养基CPA、选择性培养基PARP-V8和卵孢子培养基,具体配方参见附 录B。 4 检疫鉴定方法 4.1 症状检查 重点观察柑橘果实是否有褐色病变,叶和小枝是否枯萎;杜鹃属植物,观察叶片是否有深褐色病斑, 1GB/T31789—2015 或整个叶片和叶柄变褐;参见附录A。玫瑰受害症状为叶部和小枝枯萎,茎基部有深紫色到黑色病斑; 其他寄主上为根部腐烂或溃疡。 4.2 分离培养和诱集 4.2.1 寄主组织分离培养 可疑症状的根、茎、叶、果实用流水冲洗表面约15min,在病健交界处或变色部位切取边长为5mm× 5mm的样品,灭菌滤纸吸干水分,放于选择性培养基PARP-V8上,或用0.5%次氯酸钠消毒2min~ 5min,无菌水冲洗3次,灭菌滤纸吸干水分,放于胡萝卜丝培养基或稀释5倍或10倍的V8培养基上。 培养皿16℃~20℃黑暗培养4d~6d,如有真菌菌落出现,转到V8培养基上纯化,16℃~20℃ 黑暗培养。 4.2.2 土壤和介质诱集 称取25g土壤或介质,碾碎、去杂放入灭菌烧杯中,加入无菌水将土壤或介质润湿(无游离水),保 鲜膜封口,置于16℃~20℃黑暗放置。 3d~5d后在烧杯中加入灭菌水,使水层高4.0cm。取雪松松针或柑橘叶片,无菌水清洗后漂放在 水面或浸在水中,16℃~20℃黑暗放置。 2d~3d后开始检查,取有失绿或变色的松针或叶片,无菌水冲洗,灭菌滤纸吸干水分,放于选择性 培养基PARP-V8或胡萝卜丝培养基上,16℃~20℃黑暗培养。如有真菌菌落出现,转到V8培养基 上纯化,16℃~20℃黑暗培养。 4.2.3 孢子囊培养 取纯化后菌落边缘菌丝块,置于盛有10mL无菌水的培养皿中,16℃~20℃黑暗条件下诱发孢子 囊,48h后观察菌丝块周围孢子囊产生情况。 4.2.4 卵孢子培养 将分离菌转至卵孢子培养基上,7℃~8℃培养1周~2周,观察是否有卵孢子形成。 4.3 分子生物学检测 4.3.1 DNA提取 收集分离到的真菌菌丝,采用CTAB法提取核酸。参见附录C。 4.3.2 PCR检测 采用引物PHIB1和PHIB2的特异性,检测从病菌基因组DNA中PCR扩增到的基因片段。 特异性引物PHIB1和PHIB2的序列分别为5'-TCGGGTCTGAGCTAGTAGTCTT-3'和5'-CT- TCCACAACCAATTCCATTATGC-3'。 反应体系(25μL):样品DNA1μL,10×PCR缓冲液2.5μL,25mmol/LMgCl22μL,2.5mmol/L dNTPs2μL,10μmol/L引物各0.5μL,5U/μLTaqDNA聚合酶0.2μL,ddH2O16.3μL。 反应条件为94℃2min;94℃30s,68℃30s,72℃45s,35个循环;72℃10min;4℃保存。 在1×TAE电泳缓冲液中,1.5%琼脂糖(含SYBRGreenⅠ核酸染料)凝胶电泳,5V/cm,凝胶成 像仪分析结果。 4.3.3 实时荧光PCR检测 可以选择荧光PCR检测。 2GB/T31789—2015 实时荧光PCR引物序列为PH-F:5'-CGACTTGCCACCGGGA-3'和PH-R:5'-AACGGTACTT CTCTTTGCTCGAA-3',TaqMan-MGB探针PH-Pr:5'-(FAM)TTCCACAACCAATTCCAT(NFQ- MGB)-3',探针5'端标记的荧光报告基团为FAM,3'端标记的非荧光猝灭基团为MGB。 反应体系(25μL):样品DNA1μL,10×PCR缓冲液2.5μL,25mmol/LMgCl22μL,2.5mmol/L dNTPs2μL,10μmol/L引物各1μL,10μmol/L探针PH-Pr1.5μL,5U/μLTaqDNA聚合酶 0.5μL,ddH2O13.5μL。 反应循环为94℃10min;94℃15s,56℃60s,循环40次。 5 鉴定特征 5.1 菌落特征 冬生疫霉菌在V8培养基上生长速度较慢(4mm/d~8mm/d),菌落白色,平贴至中度的蓬松,呈 玫瑰花瓣状,花瓣状区域较宽且圆,V8培养基淡橘黄色。参见附录D。 5.2 病菌形态 冬生疫霉菌的孢子囊长卵圆形或椭圆形,易脱落,顶部具有不完全的乳头状突起,通常基部锥形、顶 部近半乳突处最宽。 孢子囊大小(29μm~53μm)×(14μm~22μm),长宽比较大,为1.8~2.4,孢囊柄长23μm~ 73μm。 孢囊梗不分枝或窄的长分枝,或形成不规则合轴式长侧枝。孢子囊低温萌发释放游动孢子。病菌 不产生厚垣孢子,一般无菌丝膨大体。 该菌为同宗配合,雄器多围生,偶侧生,平均10μm×15μm;卵孢子黄橙色,满器,大小为22μm~ 45.6μm,壁厚1μm~3μm;藏卵器大小为22μm~56μm。 孢子囊、雄器和卵孢子形态图参见附录D。 5.3 与近似种的形态区别 冬生疫霉菌与丁香疫霉菌(Phytophthorasyringae)在形态上很相似,主要区别为冬生疫霉菌落的 花瓣区域较宽,孢子囊易脱落,雄器多围生;丁香疫霉菌落的花瓣区域较尖、窄,孢子囊不脱落,雄器多侧 生,有菌丝膨大体。参见附录E。 5.4 PCR特异性产物 引物PHIB1和PHIB2的特异性PCR扩增目的片段为407bp。 5.5 实时荧光PCR检测 若阴性对照及空白对照的Ct值≥40,供试菌Ct值≤36,可判定为阳性。 6 结果判定 病菌的培养性状和形态特征与5.1和5.2的描述一致,且PCR检测结果或实时荧光PCR检测结果 呈阳性,可判定为冬生疫霉菌。 3GB/T31789—2015 7 样品和档案保存 7.1 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出冬生疫霉菌的样品应保存于10℃冰箱中,至少保存 6个月,以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。 7.2 菌株保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为冬生疫霉菌的菌株,应妥善保存。将菌株接种于PDA培养基斜面上, 20℃培养5d,10℃黑暗条件下保存,定期(60d)转接防止病菌死亡,至少保存6个月。保存期满后高 压灭菌灭活处理。 7.3 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括:样品的来源、种类、时间,实验的时间、地点、方法和结果等,并应有实验人员 和审核人员签字。 4GB/T31789—2015 附 录 A (资料性附录) 冬生疫霉菌相关信息 A.1 背景资料 A.1.1 病菌的基本信息 英文名:Citrusfruitbrownrot,Citrusleafblight 学名:PhytophthorahibernalisCarne 分类地位:藻菌界(Chromista),卵菌门(Oomycota),霜霉纲(Peronosporea),霜霉目(Peronospora- les),霜霉科(Peronosporaceae),疫霉属(Phytopht