ICS67.050 X04 中华人民共和国国家标准 GB/T31730—2015 水稻中转基因成分测定 膜芯片法 Detectionofgeneticallymodifiedcomponentsinrice— Membrane-basedarraymethod 2015-06-02发布 2015-09-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中国标准化研究院归口。 本标准起草单位:四川华汉三创生物科技有限公司、中国标准化研究院、黑龙江省粮油卫生检验监 测站。 本标准主要起草人:黄广平、云振宇、尹志坚、胡太贵、孙昭、张瑶、王勇强、董玖红、宋廷瑞、张金龙、 刘贞。 ⅠGB/T31730—2015 水稻中转基因成分测定 膜芯片法 1 范围 本标准规定了水稻及水稻加工产品中转基因成分的检测方法。 本标准适用于转BAR基因耐除草剂水稻和转Bt基因(Cry1Ab/Cry1Ac)抗虫水稻中转基因成分 的快速定性检测,也适用于水稻加工产品中以上成分的快速定性检测。 本标准规定的转基因成分最低检测限量是1g/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.1 转基因产品检测 通用要求和定义 GB/T19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 GB/T19495.3 转基因产品检测 核酸提取纯化方法 GB/T19495.6 转基因产品检测 基因芯片检测方法 GB/T19495.7 转基因产品检测 抽样和制样方法 3 术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 GB/T19495.1、GB/T19495.6界定的术语和定义适用于本文件。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate) dATP:脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosinetriphosphate) dCTP:脱氧胞苷三磷酸(deoxycytidinetriphosphate) dGTP:脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosinetriphosphate) dTTP:脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidinetriphosphate) dUTP:脱氧尿苷三磷酸(deoxyuridinetriphosphate) bp:碱基对(basepair) BAR:草丁膦乙酰转移酶基因(phosphinothricinacetyltransferasegene) Cry1Ab:苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白cry1A(b)基因[Bacillusthuringiensisinsecticidaltoxin cry1A(b)gene] Cry1Ac:苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白cry1A(c)基因[Bacillusthuringiensisinsecticidaltoxin cry1A(c)gene] 1GB/T31730—2015 CaMV35S-P:花椰菜花叶病毒的35S启动子(promoterfromcauliflowermosaicvirus) NOS-3’:胭脂碱合成酶基因终止子(terminationsequenceofthenopalinesynthasegene) CaMV35S-T:花椰菜花叶病毒的35S终止子(terminationsequencefromcauliflowermosaicvirus) GOS9:水稻gos9基因[Oryzasativa(rice)gos9gene] PC:阳性对照(positivecontrol) NC:阴性对照(negativecontrol) UNG酶:尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)(uracilN-glycosylase) Taq酶:ThermusaquaticusDNA聚合酶(ThermusaquaticusDNApolymerase) AminolinkerC6:6个碳原子作为连接臂的氨基标记(C6Aminolinker) 4 原理 根据转基因水稻中常见转基因片段和调控元件设计特异性多重PCR引物,对样本进行多重PCR 扩增。PCR引物上修饰有生物素。若样本中出现目标片段而得到PCR扩增产物,PCR产物与固定有 目标基因特异性探针的膜芯片进行杂交。杂交点上的生物素和碱性磷酸酶标记链霉亲和素反应,以及 碱性磷酸酶化学显色底物进行化学显色,则可在杂交点上形成肉眼可见的杂交信号。依据膜芯片上杂 交点的显色情况,判断样本中是否含有待检转基因成分,检测结果可以用肉眼直接判断,或用芯片识读 仪对杂交芯片进行扫描并判定结果。 5 试剂与标准品 5.1 试剂 5.1.1 试剂组分 本标准中试剂组分和存放条件参见附录A和5.1.2~5.1.4的规定。除非另有规定,本方法中所用 试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的二级水。 5.1.2 引物 PCR反应使用的引物序列应符合表1的规定。 表1 PCR反应使用的引物序列 目标基因引物名称 序 列 扩增片段大小 BARForward5’-CACCTGCTGAAGTCCCTGGA-3’ Reverse5’-biotin-GTACCGGCAGGCTGAAGTCCA-3’193bp Cry1AbForward5’-GACATGAACAGCGCCTTGAC-3’ Reverse5’-biotin-TTGATGGTTGCAGCATCGAA-3’164bp Cry1AcForward5’-GTTAGACTCAACAGCAGTGGA-3’ Reverse5’-biotin-GAGAAGATGGATGAATTACCCCA-3’161bp CaMV35S-PForward5’-GGCCATCGTTGAAGATGCCTC-3’ Reverse5’-biotin-TCATCCCTTACGTCAGTGGA-3’144bp 2GB/T31730—2015 表1(续) 目标基因引物名称 序 列 扩增片段大小 NOS-3’Forward5’-TGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTT-3’ Reverse5’-biotin-GCGCGCGATAATTTATCCTAGTTT-3’113bp CaMV35S-TForward5’-CCAGATAAGGGAATTAGGGTTC-3’ Reverse5’-biotin-ACTGGATTTTGGTTTTAGGAATTAGA-3’132bp GOS9Forward5’-GACGATCCGTAGTGGAGC-3’ Reverse5’-biotin-GTAATCGTAGTTGGATTTCCACC-3’117bp 5.1.3 探针 膜芯片表面包被的目标基因探针序列应符合表2的规定。 表2 目标基因探针序列 名称 序 列 修饰基团 BAR5’-CGCGGCATGCTGCGGGCGGCCGGCTTCAAGCACGGGAACTGGCATGAC- GTGGGTTTCTG-3’5’-AminolinkerC6 Cry1Ab5’-GCAGCTAATCTTCACCTCAGCGTGCTTCGAGACGTTAGCGTGTTTGGG- CAAAGGTGGGG-3’5’-AminolinkerC6 Cry1Ac5’-TCTACCAGATATAGAGTTCGTGTGAGGTATGCTTCTGTGACCCCTAT- TCACCTCAACGT-3’5’-AminolinkerC6 CaMV35S-P5’-AGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCA- AGTGGATTGATG-3’5’-AminolinkerC6 NOS-3’5’-TTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAA- CAAAATATAGCGC-3’5’-AminolinkerC6 CaMV35S-T5’-AGCATATAAGAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAAATACTT- CTATCAATAAAAT-3’5’-AminolinkerC6 GOS95’-GCCTTTACATACGTTGGCACGGACGGGAATGAACATCTTGCAGGTCC- TTGGGGTGGTGG-3’5’-AminolinkerC6 PC5’-GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGAGAAGAACGAGTG- TCCAAAGTACCAG-3’5’-AminolinkerC6 NC5’-GGTTCCTTGAGAAATGTTTTACGGGATTACTTCCATGTTTGTTGGAT- GATCCTATTTTC-3’5’-AminolinkerC6 注:阳性寡核苷酸单链DNA(Positive-Oligo,10μmol/L):核苷酸序列与阳性对照核酸探针(PC)序列互补,用于 膜芯片杂交过程质量控制,5’端带生物素(biotin)标记,序列如下: 5’-biotin-CTGGTACTTTGGACACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-3’ 5.1.4 其他试剂 5.1.4.1 碱性磷酸酶标记链霉亲和素(AP-streptavidin)。 5.