书 书 书犐犆犛 １１ ． ２２０ 犅 ４１ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２２９１７ — ２００８ 猪水泡病病毒荧光 犚犜犘犆犚 检测方法 犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳犳犾狌狅狉狅犵犲狀犻犮犚犜犘犆犚犳狅狉狊狑犻狀犲狏犲狊犻犮狌犾犪狉犱犻狊犲犪狊犲狏犻狉狌狊 　　 ２００８  １２  ３１ 发布 ２００９  ０５  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准参考了世界动物卫生组织 （ ＯＩＥ ）《 陆生动物诊断试验和疫苗手册 （ 哺乳动物 、 禽鸟与蜜蜂 ）》 （ 第 ５ 版 ）。 本标准的附录 Ａ 为规范性附录 。 本标准由中华人民共和国农业部提出 。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口 。 本标准起草单位 ： 中华人民共和国深圳出入境检验检疫局 、 中华人民共和国云南出入境检验检 疫局 。 本标准主要起草人 ： 花群义 、 卢体康 、 吕建强 、 阮周曦 、 杨云庆 、 周晓黎 、 杨素 、 董俊 、 陈书琨 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２２９１７ — ２００８ 猪水泡病病毒荧光 犚犜犘犆犚 检测方法 １ 　 范围 本标准规定了猪水泡病病毒荧光 ＲＴＰＣＲ 检测的操作方法 。 本标准适用于动物及其产品中猪水泡病病毒的检测 。 ２ 　 缩略语 下列缩略语适用于本标准 。 ２ ． １ 　 荧光 犚犜犘犆犚 荧光反转录  聚合酶链反应 。 ２ ． ２ 　 犆狋 值 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数 。 ２ ． ３ 　 犚犖犃 核糖核酸 。 ２ ． ４ 　 犇犈犘犆 焦碳酸磷酯 。 ２ ． ５ 　 犘犅犛 磷酸盐缓冲盐水 ， 配方见附录 Ａ 。 ２ ． ６ 　 犜犪狇 酶 犜犪狇 ＤＮＡ 聚合酶 。 ２ ． ７ 　 犛犞犇犞 猪水泡病病毒 。 ３ 　 原理 根据猪水泡病病毒的基因特定序列 ， 合成一对特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针 。 引物 和探针通过严格的设计和筛选 ， 涵盖已报道的所有猪水泡病病毒的毒株 。 荧光探针的 ５′ 端标记 ＦＡＭ 荧光素 ， ３′ 端标记 ＴＡＭＲＡ 荧光素 ， 它在近距离内能吸收 ５′ 端报告荧光基团发出的荧光信号 。 扩增时 ， 由于 犜犪狇 酶的 ５′ → ３′ 的外切活性 ， 在延伸到荧光探针时 ， 将其切断 ， 两基团分离 ， 淬灭作用消失 ， 荧光信 号产生 。 因此 ， 可以通过检测荧光信号对核酸模板进行检测 。 ４ 　 材料与试剂 ４ ． １ 　 仪器与器材 ４ ． １ ． １ 　 荧光 ＲＴＰＣＲ 检测仪 。 ４ ． １ ． ２ 　 高速台式冷冻离心机 （ 离心速度 １２０００ｒ ／ ｍｉｎ 以上 ）。 ４ ． １ ． ３ 　 台式离心机或手掌式离心机 （ 离心速度 ３０００ｒ ／ ｍｉｎ ）。 ４ ． １ ． ４ 　 混匀器 。 ４ ． １ ． ５ 　 冰箱 （ ２℃ ～ ８℃ 和 －２０℃ 两种 ）。 ４ ． １ ． ６ 　 微量可调移液器 （ ５ μ Ｌ ， １０ μ Ｌ ， １００ μ Ｌ ， １０００ μ Ｌ ） 及配套带滤芯吸头 。 ４ ． １ ． ７ 　 １．５ｍＬ 、 ０．５ｍＬ 硅化 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 管 ： 将 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 管和滴头浸泡于含有 ０．１％ＤＥＰＣ 的三蒸水 中过夜 ， １２１℃±２℃ 高压灭菌 １５ｍｉｎ ， ４０℃ 烘干备用 。 市售 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 管和滴头已经硅化 ， 可直接 １ 犌犅 ／ 犜 ２２９１７ — ２００８ 使用 。 ４ ． １ ． ８ 　 ０．２ｍＬ 透明薄壁 ＰＣＲ 管 。 ４ ． １ ． ９ 　 ６×６ 孔或 ５×８ 孔冰盒 。 ４ ． １ ． １０ 　 水浴锅 ： ０℃ ～ １００℃ 。 ４ ． １ ． １１ 　 旋涡振荡器 。 ４ ． ２ 　 试剂 ４ ． ２ ． １ 　 本标准所用试剂均为分析纯 ， 所有试剂均用无 ＲＮＡ 酶污染的容器 （ 用 ＤＥＰＣ 水处理后高压灭 菌 ） 分装 。 ４ ． ２ ． ２ 　 三氯甲烷 。 ４ ． ２ ． ３ 　 异丙醇 ： －２０℃ 预冷 。 ４ ． ２ ． ４ 　 ＰＢＳ ： 配制方法见附录 Ａ 。 ４ ． ２ ． ５ 　 ７５％ 乙醇 ： 用新开启的无水乙醇和 ＤＥＰＣ 水配制 ， －２０℃ 预冷 。 ４ ． ２ ． ６ 　 裂解液 ： 配制方法见附录 Ａ 。 ４ ． ２ ． ７ 　 酚 （ 分析纯 ）。 ４ ． ２ ． ８ 　 无水乙醇 （ 分析纯 ）。 ４ ． ２ ． ９ 　 ＡＭＶ 反转录酶 （ ５Ｕ ／ μ Ｌ ）： －２０℃ 保存 ， 不要反复冻融或温度剧烈变化 。 ４ ． ２ ． １０ 　 ｄＮＴＰｓ ： 含 ｄＣＴＰ 、 ｄＧＴＰ 、 ｄＡＴＰ 、 ｄＴＴＰ 各 １０ｍｍｏＬ ／ Ｌ 。 ４ ． ２ ． １１ 　 ＲＮＡ 酶抑制剂 （ ＲＮａｓｉｎ ， ４０Ｕ ／ μ Ｌ ）： －２０℃ 保存 ， 不要反复冻融或温度剧烈变化 。 ４ ． ２ ． １２ 　 犜犪狇 ＤＮＡ 聚合酶 （ ５Ｕ ／ μ Ｌ ）： －２０℃ 保存 ， 不要反复冻融或温度剧烈变化 。 ４ ． ２ ． １３ 　 反转录和 ＰＣＲ 缓冲液 （ ５× ）： 配制方法见附录 Ａ 。 ４ ． ２ ． １４ 　 氯化镁 （ ２５ｍｍｏｌ ／ Ｌ ）。 ４ ． ２ ． １５ 　 引物 （ １５ μ ｍｏｌ ／ Ｌ ）： 上游引物 ５′ＧＧＣＡＡＣＧＣＡＴＡＣＡＧＣＡＴＧＴＴ３′ ； 下游引物 ５′ＧＣＣＧ ＴＡＴＧＴＣＣＣＴＴＧＣＴＴＧＴ３′ 。 ４ ． ２ ． １６ 　 荧光双标记探针 （ １０ μ ｍｏｌ ／ Ｌ ）：（ ＦＡＭ ） ５′ＴＡＴＧＡＣＧＧＧＴＧＧＧＣＣＡＧＧＴＴ３′ （ ＴＡＭＲＡ ）。 ４ ． ２ ． １７ 　 ＤＥＰＣ 处理水 ： 按 ０．１％ 加入 ＤＥＰＣ ， 摇匀 ， 室温静置过夜 ， １２１℃±２℃ 高压灭菌 ２０ｍｉｎ ， 冷却 备用 。 ５ 　 抽样 ５ ． １ 　 采样工具 ５ ． １ ． １ 　 下列采样工具应经 １２１℃±２℃ ， １５ｍｉｎ 高压灭菌并烘干 。 ５ ． １ ． ２ 　 棉拭子 。 ５ ． １ ． ３ 　 剪刀 、 镊子 。 ５ ． １ ． ４ 　 注射器 。 ５ ． １ ． ５ 　 １．５ｍＬＥｐｐｅｎｄｏｒｆ 管 。 ５ ． １ ． ６ 　 研钵 。 ５ ． １ ． ７ 　 真空采血管 。 ５ ． １ ． ８ 　 记号笔 。 ５ ． １ ． ９ 　 低温保藏箱或冰盒 。 ５ ． ２ 　 样品采集 ５ ． ２ ． １ 　 采集的样品主要是口腔 、 蹄冠上的水泡上皮组织 、 水泡液 、 血液 、 口腔分泌物和组织 。 采集后立 即冷藏送检或置于含抗生素的 ＰＢＳ 缓冲液中 ４℃ 环境下保藏 。 编号并作好记录 。 ５ ． ２ ． ２ 　 水泡液及水泡皮 ： 只有当水泡完整时才能采集到水泡液 ， 用 ７５％ 酒精轻轻消毒水泡表皮 ， 尽量 去掉污物 ， 用灭菌生理盐水擦去酒精 ， 然后用无菌注射器穿刺水泡吸取水泡液 ， 置于含抗生素的 ＰＢＳ 缓 ２ 犌犅 ／ 犜 ２２９１７ — ２００８ 冲液灭菌瓶中 。 水泡液采取后 ， 将水泡皮以无菌术剪下 ， 放入含抗生素的 ＰＢＳ 缓冲液中 。 ５ ． ２ ． ３ 　 口腔分泌物和咽喉拭子 ： 用拭子采取口腔分泌物或将拭子深入口腔内来回刮 ３ 次 ～ ５ 次取分泌 液 ， 拭子一并放入盛有 １．０ｍＬ 含抗生素的 ＰＢＳ 缓冲液的 １．５ｍＬＥｐｐｅｎｄｏｒｆ 管中 。 也可用食道探杯刮 取咽喉液体 ， 放入加有抗生素的 ＰＢＳ 中 。 编号 ， 冷藏送检或低温保藏 。 ５ ． ２ ． ４ 　 血液 ： 用真空采血管或无菌注射器直接采取至无菌 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 管中 ， 密封 、 编号后保存于 ４℃ 环 境中送检 。 ５ ． ２ ． ５ 　 肌肉或组织脏器 ： 无菌采集待检样品 ， 装入一次性塑料袋或其他灭菌容器 ， 编号 ， 冷藏送检或低 温保藏 。 ５ ． ３ 　 样品贮运 样品采集后 ， 放入密闭的塑料袋内 （ 一个采样点的样品 ， 放入一个塑料袋内 ）， 于保温箱中加冰 、 密 封 ， 送实验室 。 ５ ． ４ 　 样品制备 ５ ． ４ ． １ 　 水泡液 、 血液和口腔分泌物 样品在混匀器上充分混合后 ， 用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出 ， 室温放置 ３０ｍｉｎ ， 取上清液转 入无菌的 １．５ｍＬＥｐｐｅｎｄｏｒｆ 管中 ， 编号备用 。 ５ ． ４ ． ２ 　 水泡皮 、 肌肉或组织脏器 取待检样品 ２．０ｇ 于洁净 、 灭菌并烘干的研钵中充分研磨 ， 加 １０ｍＬＰＢＳ 混匀 ， ４℃ 下以 ３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １５ｍｉｎ ， 取上清液转入无菌的 １．５ｍＬＥｐｐｅｎｄｏｒｆ 管中 ， 编号备用 。 ５ ． ５ 　 样本存放 制备的样本在 ２℃ ～ ８℃ 条件下保存应不超过 ２４ｈ ， 若需长期保存应置 －７０℃ 以下 ， 但应避免反复 冻融 （ 冻融不超过三次 ）。 ６ 　 操作方法 ６ ． １ 　 实验室要求 猪水泡病病毒荧光 ＲＴＰＣＲ 检测的实验室分为三个相对独立的工作区域 ： 样本制备区 、 反应混合 物配制区和检测区 ； 各工作区域应有明确标记 ， 避免不同工作区域内的设备 、 物品混用 ； 每一区域应有专 用的仪器设备 ； 进入各个工作区域应严格遵循单一方向顺序 ， 即只能从样本制备区 、 扩增反应混合物配 制区至检测区 。 ６