书 书 书犐犆犛 １１ ． ２２０ 犅 ４１ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２２９１５ — ２００８ 口蹄疫病毒荧光 犚犜犘犆犚 检测方法 犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳狌狀犻狏犲狉狊犪犾犳犾狌狅狉狅犵犲狀犻犮犚犜犘犆犚犳狅狉犳狅狅狋犪狀犱犿狅狌狋犺犱犻狊犲犪狊犲狏犻狉狌狊 ２００８  １２  ３１ 发布 ２００９  ０５  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准参考了世界动物卫生组织 （ ＯＩＥ ）《 陆生动物诊断试验和疫苗手册 （ 哺乳动物 、 禽鸟与蜜蜂 ）》 （ 第 ５ 版 ）。 本标准的附录 Ａ 、 附录 Ｃ 为规范性附录 ， 附录 Ｂ 为资料性附录 。 本标准由中华人民共和国农业部提出 。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口 。 本标准起草单位 ： 中华人民共和国深圳出入境检验检疫局 、 中华人民共和国云南出入境检验检疫 局 、 中国检验检疫科学研究院 。 本标准主要起草人 ： 花群义 、 杨云庆 、 秦智锋 、 周晓黎 、 卢体康 、 董俊 、 陶虹 、 阮周曦 、 叶弈优 、 林祥梅 、 吴绍强 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２２９１５ — ２００８ 口蹄疫病毒荧光 犚犜犘犆犚 检测方法 １ 　 范围 本标准规定了口蹄疫病毒荧光 ＲＴＰＣＲ 检测的操作方法 。 本标准适用于动物及其动物产品中口蹄疫病毒的检测 。 ２ 　 缩略语 下列缩略语适用于本标准 。 ２ ． １ 　 荧光 犚犜犘犆犚 荧光反转录  聚合酶链反应 。 ２ ． ２ 　 犆狋 值 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数 。 ２ ． ３ 　 犚犖犃 核糖核酸 。 ２ ． ４ 　 犇犈犘犆 焦碳酸磷酯 。 ２ ． ５ 　 犘犅犛 磷酸盐缓冲盐水 ， 配方见附录 Ａ 。 ２ ． ６ 　 犜犪狇 酶 犜犪狇 ＤＮＡ 聚合酶 。 ２ ． ７ 　 犉犕犇犞 口蹄疫病毒 。 ３ 　 原理 根据口蹄疫病毒各型共有的基因特定序列的保守片段 ， 合成一对通用的特异性引物和一条通用的 特异性探针 。 荧光探针的 ５′ 端标记 ＦＡＭ 荧光素 ， ３′ 端标记 ＴＡＭＲＡ 荧光素 ， ３′ 端的淬灭基团在近距离 内能吸收 ５′ 端报告荧光基团发出的荧光信号 。 但在扩增时 ， 由于 犜犪狇 酶的 ５′ → ３′ 的外切活性 ， 在延伸 到荧光探针时 ， 将其切断 ， 两基团分离 ， 淬灭作用消失 ， 荧光信号产生 。 因此 ， 可以通过检测荧光信号对 核酸模板进行检测 。 ４ 　 材料与试剂 ４ ． １ 　 仪器与器材 ４ ． １ ． １ 　 荧光 ＲＴＰＣＲ 检测仪 。 ４ ． １ ． ２ 　 高速台式冷冻离心机 （ 离心速度 １２０００ｒ ／ ｍｉｎ 以上 ）。 ４ ． １ ． ３ 　 台式离心机 （ 离心速度 ３０００ｒ ／ ｍｉｎ ）。 ４ ． １ ． ４ 　 混匀器 。 ４ ． １ ． ５ 　 冰箱 （ ２℃ ～ ８℃ 和 －２０℃ 两种 ）。 ４ ． １ ． ６ 　 微量可调移液器 （ ５ μ Ｌ ， １０ μ Ｌ ， １００ μ Ｌ ， １０００ μ Ｌ ） 及配套带滤芯吸头 。 ４ ． １ ． ７ 　 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 管 （ １．５ｍＬ ）、 透明薄壁 ＰＣＲ 管 （ ０．２ｍＬ ）。 １ 犌犅 ／ 犜 ２２９１５ — ２００８ ４ ． ２ 　 试剂 ４ ． ２ ． １ 　 除特别说明以外 ， 本标准所用试剂均为分析纯 ， 所有试剂均用无 ＲＮＡ 酶污染的容器 （ 用 ＤＥＰＣ 水处理后高压灭菌 ） 分装 。 ４ ． ２ ． ２ 　 三氯甲烷 。 ４ ． ２ ． ３ 　 异丙醇 ： －２０℃ 预冷 。 ４ ． ２ ． ４ 　 ＰＢＳ ： 配制见附录 Ａ 。 ４ ． ２ ． ５ 　 ７５％ 乙醇 ： 用新开启的无水乙醇和 ＤＥＰＣ 水配制 ， －２０℃ 预冷 。 ４ ． ２ ． ６ 　 引物 ： 上游引物 ５′ＴＴＡＣＡＡＡＣＣＴＧＴＧＡＴＧＧＣＣＴＣ３′ ， 下游引物 ５′ＣＧＧＡＧＡＴＣＡＡＣＴ ＴＣＴＣＣＴＧＴＡＴＧ３′ 。 ４ ． ２ ． ７ 　 荧光双标记探针 （ １０ μ ｍｏｌ ／ Ｌ ）：（ ＦＡＭ ） ５′ＣＣＴＣＴＣＣＴＴＴＧＣＡＣＧＣＣＧＴＧＧ３′ （ ＴＡＭＲＡ ）。 ４ ． ２ ． ８ 　 口蹄疫病毒通用荧光 ＲＴＰＣＲ 检测试剂盒 ： 组成 、 功能及使用注意事项参见附录 Ｂ 。 ５ 　 抽样 ５ ． １ 　 采样工具 ５ ． １ ． １ 　 下列采样工具应经 １２１℃±２℃ ， １５ｍｉｎ 高压灭菌并烘干 。 ５ ． １ ． ２ 　 棉拭子 。 ５ ． １ ． ３ 　 剪刀 、 镊子 。 ５ ． １ ． ４ 　 注射器 。 ５ ． １ ． ５ 　 １．５ｍＬＥｐｐｅｎｄｏｒｆ 管 。 ５ ． １ ． ６ 　 研钵 。 ５ ． ２ 　 样品采集 ５ ． ２ ． １ 　 采集的样品主要是口腔 、 蹄冠上的水泡上皮组织 、 水泡液 、 血液 、 口腔分泌物和组织 。 采集后立 即冷藏送检或置于含抗生素的 ＰＢＳ 缓冲液中低温保藏 。 编号并作好记录 。 ５ ． ２ ． ２ 　 水泡液及水泡皮 ： 用 ７５％ 酒精轻轻消毒水泡表皮 ， 去掉污物 ， 用灭菌生理盐水擦去酒精 ， 然后用 无菌注射器穿刺水泡吸取水泡液 ， 置于含抗生素的 ＰＢＳ 缓冲液灭菌瓶中 。 水泡液采取后 ， 将水泡皮以 无菌术剪下 ， 放入含抗生素的 ＰＢＳ 缓冲液中 。 ５ ． ２ ． ３ 　 口腔分泌物和咽喉拭子 ： 用拭子采取口腔分泌物或将拭子深入口腔内来回刮 ３ 次 ～ ５ 次取分泌 液 ， 拭子一并放入盛有 １．０ｍＬ 含抗生素的 ＰＢＳ 缓冲液的 １．５ｍＬＥｐｐｅｎｄｏｒｆ 管中 。 也可用食道探杯刮 取咽喉液体 ， 放入加有抗生素的 ＰＢＳ 中 。 编号 ， 冷藏送检或低温保藏 。 ５ ． ２ ． ４ 　 血液 ： 用真空采血管或无菌注射器直接采取至无菌 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 管中 ， 密封 、 编号后保存于 ４℃ 或 送检 。 ５ ． ２ ． ５ 　 肌肉或组织脏器 ： 无菌采集待检样品 ， 装入一次性塑料袋或其他灭菌容器 ， 编号 ， 冷藏送检或低 温保藏 。 ５ ． ３ 　 样品贮运 样品采集后 ， 放入密闭的塑料袋内 （ 一个采样点的样品 ， 放入一个塑料袋内 ）， 于保温箱中加冰 、 密 封 ， 送实验室 。 ５ ． ４ 　 样品制备 ５ ． ４ ． １ 　 水泡液 、 血液和口腔分泌物 样品在混匀器上充分混合后 ， 用经高压灭菌的镊子将拭子中的液体挤出 ， 室温放置 ３０ｍｉｎ ， 取上清 液转入无菌的 １．５ｍＬＥｐｐｅｎｄｏｒｆ 管中 ， 编号备用 。 ５ ． ４ ． ２ 　 水泡皮 、 肌肉或组织脏器 取待检样品 ２．０ｇ 于洁净 、 灭菌并烘干的研钵中充分研磨 ， 加 １０ｍＬＰＢＳ 混匀 ， ４℃ 下 ３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １５ｍｉｎ ， 取上清液转入无菌的 １．５ｍＬＥｐｐｅｎｄｏｒｆ 管中 ， 编号备用 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ２２９１５ — ２００８ ５ ． ５ 　 样本存放 制备的样本在 ２℃ ～ ８℃ 条件下保存应不超过 ２４ｈ ， 若需长期保存应置 －７０℃ 以下 ， 但应避免反 复冻融 （ 冻融不超过三次 ）。 ６ 　 操作方法 ６ ． １ 　 实验室标准化设置与管理要求 口蹄疫病毒荧光 ＲＴＰＣＲ 检测的实验室规范 ， 见附录 Ｃ 。 ６ ． ２ 　 样本的处理 ６ ． ２ ． １ 　 在样本制备区进行 。 样品中总 ＲＮＡ 提取的试剂盒 ， 有商品化试剂盒出售 ， 也可自行配制 。 ６ ． ２ ． ２ 　 取 狀 个灭菌的 １．５ｍＬＥｐｐｅｎｄｏｒｆ 管 ， 其中 狀 为被检样品 、 阳性对照与阴性对照的数量之和 ， 编号 。 ６ ． ２ ． ３ 　 每管加入 ６００ μ Ｌ 裂解液 ， 分别加入被检样本 、 阴性对照 、 阳性对照各 ２００ μ Ｌ ， 一份样本换用一 个吸头 ， 再加入 ２００ μ Ｌ 三氯甲烷 ， 混匀器上振荡混匀 ５ｓ 。 于 ４℃ 、 以 １２０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １５ｍｉｎ 。 ６ ． ２ ． ４ 　 取与 ６．２．２ 相同数量灭菌的 １．５ｍＬＥｐｐｅｎｄｏｒｆ 管 ， 加入 ５００ μ Ｌ 异丙醇 （ －２０℃ 预冷 ）， 做标 记 。 吸取 ６．２．３ 各管中的上清液转移至相应的管中 ， 上清液应至少吸取 ５００ μ Ｌ ， 不能吸出中间层 ， 颠倒 混匀 。 ６ ． ２ ． ５ 　 于 ４℃ 、 以 １２０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １５ｍｉｎ （ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 管开口保持朝离心机转轴方向放置 ）， 小心倒 去上清液 ， 倒置于吸水纸上 ， 沾干液体 ， 不同样品应在吸水纸不同地方沾干 ； 加入 ６００ μ Ｌ７５％ 乙醇 ， 颠倒 洗涤 。 ６ ． ２ ． ６ 　 于 ４℃ 、 以 １２０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ （ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 管开口保持朝离心机转轴方向放置 ）， 小心倒 去上清液 ， 倒置于吸水纸上 ， 沾干液体 ， 不同样品应在吸水纸不同地方沾干 。 ６ ． ２ ． ７ 　 以 ４０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｓ （ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 管开口保持朝离心机转轴方向放置 ）， 将管壁上的残余液 体甩到管底部 ， 小心倒去上清液 ， 用微量加样器将其吸干 ， 一份样本换用一个吸头 ， 吸头不要碰到有沉淀 一面 ， 室温干燥