SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3972—2014 猪流感病毒病检疫技术规范 Quarantine protocol for swine influenza disease 行业标准信息服务平台 2014-07-14发布 2015-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3972—2014 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民 共和国广东出人境检验检疫局、广东省农业科学院动物卫生研究所。 本标准主要起草人：卢体康、孙洁、张彩虹、秦智锋、曾少灵、林庆燕、宋长绪、刘建利、陈茹、陈书琨、 陶虹、唐金明、陈兵、胡运发。 行业标准信息服务平台 1 SN/T3972—2014 猪流感病毒病检疫技术规范 1范围 本标准规定了猪流感的临床诊断、病原学和血清学检疫技术要求。 本标准适用于对进出境猪流感的诊断、检疫和监测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出入境动物检疫采样 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 pH,Ni（2009）：甲型HN（2009）流感病毒 SI:猪流感 SIV:猪流感病毒 4概述 猪流感病毒一年四季均可在猪群中流行，不同品种、年龄的猪均可感染。病猪是重要传染源，康复 猪可能成为长期的带毒和排毒者。本病的主要传播途径包括直接接触传播和空气传播。病猪突然发 烧，体温在40.5℃～41.5℃之间，有时达42℃。病理变化主要发生在呼吸器官，鼻、喉、气管及大支气 管黏膜充血、肿胀并覆有黏稠的液体，小支气管和细支气管充填渗出物，胸腔蓄积多量混有纤维素的浆 液，纵膈淋巴结和支气管淋巴结肿大，肺脏的病变多发生在尖叫、心叶、中间叶及隔叶的背部和基底部， 呈紫红色，坚实，塌陷，而周围的肺组织则呈苍白色气肿状态，界限分明，肺的间质增宽，并出现炎症变 服务平台 化，心包腔蓄积混有纤维素状的液体，胃肠黏膜呈现卡他性炎；脾脏微肿 5 5病原学检测 5.1病毒分离与鉴定 5.1.1材料 5.1.1.1号 器材与设备 棉拭子、剪刀、镊子、注射器、离心管、高速台式冷冻离心机、漩涡振荡器、研钵、匀浆器、微量可调移 液器、冰箱、生物安全柜、照蛋器、打孔器、酒精灯、1.0mL一次性灭菌注射器、孵蛋器、细胞培养瓶、吸 管、洗耳球或电动助吸器、二氧化碳培养箱、倒置显微镜。 1 SN/T 3972—2014 5.1.1.2试剂 符合GB/T6682所规定的一级水，胎牛血清，9～11日龄SPF鸡胚，犬肾传代细胞，石蜡、5%碘酐、 75%酒精，青霉素、链霉素、双抗贮存液、pH7.20.01mol/LPBS、细胞生长液、细胞维持液、细胞消化液 等溶液（配制方法见A.1)。 5.1.2样品的采集与处理 5.1.2.1一般要求 样品的采集、保存及运输应符合GB/T18088的相关要求 5.1.2.2鼻腔拭子 将灭菌的棉拭子插人猪鼻腔，轻轻擦拭35次并慢慢旋转，然后取出拭子并放人盛有2mL灭菌 的0.01mol/LpH7.2PBS（含青霉素10000IU/mL，链霉素10000μg/mL)管内，加盖编号。 5.1.2.3肺脏组织 采集新鲜的可疑病变肺脏组织约3.0g~4.0g，放置于无菌平皿中，编号。 5.1.2.4血清或血浆 用无菌注射器直接吸取至无菌1.5mL离心管中，编号。 5.1.2.5样品的保存和运输 待检样品在2℃～8℃保存不应超过24h；一20℃保存不超过3个月；一80℃以下可长期保存。 样品应置于低温、密封的容器内运输。 5.1.2.6样品制备 鼻腔拭子样品于旋涡振荡器上振荡混匀约5s后，于离心机中瞬时离心待用。血清或血浆样品于 台式冷冻离心机上3000r/min冷冻离心5min后取上清待用。组织样品，用无菌的剪刀和镊子剪取待 检样品2.0g于研钵中充分研磨，再加10mLPBS（含青霉素10000IU/mL，链霉素10000μg/mL）混 匀，或置于组织匀浆器中，加入10mLPBS（含青霉素10000IU/mL，链霉索10000μg/mL)匀浆，然后 将组织悬液转人无菌1.5mL离心管中3000/min4℃离心15min，取上清液转人另一无菌1.5mL离 信息服务 心管中，编号备用。 5.1.3病毒分离 5.1.3.1鸡胚分离病毒 5.1.3.1.1将9~11日龄SPF鸡胚用照蛋器照视检查，在气室边缘上2mm~8mm处避开血管作一 标记。 5.1.3.1.2 将鸡胚竖放在蛋座上，钝端向上。用5%碘酐消毒蛋壳气室后，用75%的酒精脱碘消毒，用 无菌处理的打孔器在标记处钻一小孔（勿损伤壳膜）。 5.1.3.1.3用1.0mL注射器吸取0.2mL处理好的样品，针头刺人孔内，经绒毛尿囊膜注入尿囊腔，如 图1所示，每个样品接种5个鸡胚 情况，以后每间隔8h观察一次，记录鸡胚死亡情况。 2