书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ３０ 犅 ４４ 　 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 １４９２６ ． ４６ — ２００８ 代替 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．４６ — ２００１ 实验动物 　 钩端螺旋体检测方法 犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔犪狀犻犿犪犾 — 犕犲狋犺狅犱犳狅狉犲狓犪犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳 犔犲狆狋狅狊狆犻狉犪 狊狆狆． ２００８  １２  ０３ 发布 ２００９  ０３  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书中华人民共和国 国家标准 实验动物 　 钩端螺旋体检测方法 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．４６ — ２００８  中国标准出版社出版发行 北京复兴门外三里河北街 １６ 号 邮政编码 ： １０００４５ 网址 ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ 电话 ： ６８５２３９４６ 　 ６８５１７５４８ 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 各地新华书店经销  开本 ８８０×１２３０１ ／ １６ 　 印张 ０．５ 　 字数 ９ 千字 ２００９ 年 ２ 月第一版 　 ２００９ 年 ２ 月第一次印刷  书号 ： １５５０６６ · １３５７６７ 如有印装差错 　 由本社发行中心调换 版权专有 　 侵权必究 举报电话 ：（ ０１０ ） ６８５３３５３３ 书 书 书前 　　 言 　　 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６ 《 实验动物 》 共 ５４ 个部分 ， 为不同微生物和病毒检测技术方法 。 本部分自实施之日起代替 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．４６ — ２００１ 《 实验动物 　 钩端螺旋体检测方法 》。 本部分与 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．４６ — ２００１ 相比主要技术差异如下 ： ａ ） 　 原理部分增加显微镜凝集试验原理 ； ｂ ） 　 原标准中 “ ６．１ 　 试管凝集实验 ” 修改为 “ 显微镜凝集实验 ”；“ ６．１．２．２ 　 表 １ 　 钩端螺旋体定量 显凝试验操作方法 ” 更改为 “ 钩端螺旋体定量显微镜凝集试验操作方法 ”； ｃ ） 　 修改原标准中所有关于酶联免疫吸附试验的内容 ； ｄ ） 　 在原标准中增加了 “ ７ 　 结果判定 ”。 本部分由全国实验动物标准化技术委员会提出并归口 。 本部分由全国实验动物标准化技术委员会负责起草 。 本部分主要起草人 ： 范薇 、 田克恭 、 贺争鸣 。 本部分所代替标准历次版本发布情况为 ： ——— ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．４６ — ２００１ 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 １４９２６ ． ４６ — ２００８ 实验动物 　 钩端螺旋体检测方法 １ 　 范围 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６ 的本部分规定了实验动物钩端螺旋体的检测方法 。 本部分适用于犬钩端螺旋体的检测 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６ 的本部分的引用而成为本部分的条款 。 凡是注日期的引用文 件 ， 其随后所有的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本部分 ， 然而 ， 鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本 部分 。 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．４２ 　 实验动物 　 细菌学检测 　 标本采集 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．４３ 　 实验动物 　 细菌学检测 　 染色法 、 培养基和试剂 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．５０ 　 实验动物 　 酶联免疫吸附试验 ３ 　 原理 钩端螺旋体抗原与相应特异性抗体相遇 ， 在适宜的电解质存在下发生凝集现象 ， 此种凝集一般须用 暗视野显微镜检查 。 钩端螺旋体抗原与待检血清中的特异性抗体结合 ， 形成抗原抗体复合物 。 此抗原抗体复合物仍保 持其抗原活性 ， 可与相应的第二抗体酶结合物结合 。 在酶的催化作用下底物发生反应 ， 产生有色物质 。 颜色反应的深浅与待检血清中所含有的特异性抗体的量成正比 。 ４ 　 主要设备和材料 ４ ． １ 　 普通恒温培养箱 。 ４ ． ２ 　 实体显微镜 。 ４ ． ３ 　 恒温水浴箱 。 ４ ． ４ 　 高速离心机 。 ４ ． ５ 　 超声波细胞粉碎器 。 ４ ． ６ 　 酶标仪 。 ４ ． ７ 　 微量加样器 ， 容量 ５ μ Ｌ ～ ５０ μ Ｌ 和 ５０ μ Ｌ ～ ２００ μ Ｌ 。 ５ 　 培养基及试剂 ５ ． １ 　 犬型钩端螺旋体标准抗原 。 ５ ． ２ 　 标准阳性血清 。 ５ ． ３ 　 标准阴性血清 。 ５ ． ４ 　 生理盐水 。 ５ ． ５ 　 显微镜凝集抗原 ： 各群钩端螺旋体标准株接种 Ｋｏｒｔｈｏｆ 培养基 ， ２８℃ 培养 ５ｄ ～ ７ｄ 。 取样作暗视 野显微镜检查 ， 每 ４００ 倍视野不少于 ５０ 条 ， 运动活泼并无自凝现象者 ， 可作为抗原 。 ５ ． ６ 　 ＥＬＩＳＡ 抗原 ５ ． ６ ． １ 　 钩端螺旋体培养 ： 各群钩端螺旋体标准株接种 Ｋｏｒｔｈｏｆ 培养基 ， ２８℃ 培养 ５ｄ ～ ７ｄ 。 １ 犌犅 ／ 犜 １４９２６ ． ４６ — ２００８ ５ ． ６ ． ２ 　 生长良好的培养物用 １００００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ３０ｍｉｎ ， 沉淀用 ＰＢＳ 在相同条件下洗 ２ 次 。 ５ ． ６ ． ３ 　 上述沉淀用 ＰＢＳ 悬浮 ， 超声波打碎后 ， １００００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ２０ｍｉｎ ， 上清即为 ＥＬＩＳＡ 抗原 。 ５ ． ７ 　 酶结合物 ： 辣根过氧化物酶标记羊或兔抗犬 ＩｇＧ 抗体 ， 辣根过氧化物酶标记葡萄球菌蛋白 Ａ （ ＳＰＡ ）。 ５ ． ８ 　 阳性血清 ： 钩端螺旋体免疫 ＳＰＦ 犬所获得的血清 ， 或自然感染犬后所获得的血清 。 ５ ． ９ 　 阴性血清 ： 无钩端螺旋体感染犬血清 。 ５ ． １０ 　 培养基和试剂溶液的配制 ： 参照 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．４３ 和 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．５０ 执行 。 ６ 　 检测方法 ６ ． １ 　 显微镜凝集实验 ６ ． １ ． １ 　 检测程序 检测程序见图 １ 。 图 １ 　 检测程序 ６ ． １ ． ２ 　 操作步骤 ６ ． １ ． ２ ． １ 　 采样 采血 、 分离血清 。 采样方法参照 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．４２ 执行 。 ６ ． １ ． ２ ． ２ 　 血清稀释 参照表 １ 进行 。 表 １ 　 钩端螺旋体定量显微镜凝集试验操作方法 凹孔板编号 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９１０１１１２ 生理盐水 ／ ｍＬ ０．１６０．１０．１０．１０．１０．１０．１０．１０．１ ０．１ 待检血清 ／ ｍＬ０．０４ /G21 ０．１ /G21 ０．１ /G21 ０．１ /G21 ０．１ /G21 ０．１ /G21 ０．１ /G21 ０．１ /G21 ０．１ /G21 弃去 ０．１ 阴性血清 ／ ｍＬ ０．１ 阳性血清 ／ ｍＬ ０．１ 标准抗原 ／ ｍＬ ０．１０．１０．１０．１０．１０．１０．１０．１０．１０．１０．１０．１ 血清最终稀释度 １ ／ １０１ ／ ２０１ ／ ４０１ ／ ８０１ ／ １６０１ ／ ３２０１ ／ ６４０１ ／ １２８０１ ／ ２５６０ ２ 犌犅 ／ 犜 １４９２６ ． ４６ — ２００８ ６ ． １ ． ２ ． ２ ． １ 　 待检血清灭活 ： 将待检血清以 ５６℃ 水浴灭活 ３０ｍｉｎ 后备用 。 ６ ． １ ． ２ ． ２ ． ２ 　 取 ９６ 孔板 ， 第 １ 孔加入生理盐水 ０．１６ｍＬ ， 以后每孔加入生理盐水 ０．１ｍＬ ， 一直加到 第 ９ 孔 。 ６ ． １ ． ２ ． ２ ． ３ 　 在第 １ 孔中加入血清 ０．０４ｍＬ ， 混匀后 ， 吸取 ０．１ｍＬ 到第 ２ 孔 ， 如此类推 ， 直到第 ９ 孔 ， 弃 去 ０．１ｍＬ 。 ６ ． １ ． ２ ． ３ 　 对照 另标明 １０ 、 １１ 、 １２ 孔 ， 第 １０ 孔加入阴性血清 ０．１ｍＬ ， 第 １１ 孔加入阳性血清 ０．１ｍＬ ， 第 １２ 孔加入 生理盐水 ０．１ｍＬ 。 ６ ． １ ． ２ ． ４ 　 加入抗原 将各孔加入标准抗原 ０．１ｍＬ ， 混匀 ， 此时各孔血清稀释度为 １∶１０ ， １∶２０ ， １∶４０ ， １∶８０ ， １∶１６０ ， １∶３２０ ， １∶６４０ ， １∶１２８０ ， １∶２５６０ 。 具体操作见表 １ 。 置 ３７℃ 温箱 ２ｈ ， 取出后摇匀 ， 用接种环挑取 各孔中的反应物置于载玻片上 ， 在暗视野下观察结果 。 ６ ． １ ． ２ ． ５ 　 结果判定 结果判定如下 ： ａ ） 　 ＋＋＋＋ ： 几乎全部钩端螺旋体呈蝌蚪状或折光率高的团块 ， 或有大小不等的点状或块状残 片 ， 仅有少数游离的钩端螺旋体 ； ｂ ） 　 ＋＋＋ ： ７５％ 的钩端螺旋体被凝集 ， 大部分呈块状或蜘蛛状 ， 尚有 ２５％ 菌体游离 ； ｃ ） 　 ＋＋ ： ５０％ 左右的钩端螺旋体被凝集 ， 尚有 ５０％ 菌体游离 ； ｄ ） 　 ＋ ： ２５％ 左右的钩端螺旋体被凝集 ， 尚有 ７５％ 菌体游离 ； ｅ ） 　 － ： 全部菌体正常 ， 分散 ， 无凝集块 ， 菌数与对照相同 。 待检血清凝集效价在 １∶２０ 达到 “ ＋＋ ” 或以上时 ， 均判为阳性反应 。 ６ ． ２ 　 酶联免疫吸附试验 （ 犈犔犐犛犃 ） ６ ． ２ ． １ 　 包被抗原 根据滴定的最适工作浓度 ， 将抗原用包被液稀释 。 每孔 １００ μ Ｌ ， 置 ３７℃１ｈ 后再 ４℃ 过夜 。 ６ ． ２ ． ２ 　 用洗涤液洗 ３ 次 ， 每次 ５ｍｉｎ ， 叩干 。 ６ ． ２ ．