书 书 书犐犆犛 ７１ ． ０４０ ． ４０ 犌 ７６ 　 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 １４６４３ ． ２ — ２００９ 代替 ＧＢ ／ Ｔ１４６４３．２ — １９９３ 工业循环冷却水中菌藻的测定方法 第 ２ 部分 ： 土壤菌群的测定 平皿计数法 犈狓犪犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犫犪犮狋犲狉犻犪犪狀犱犪犾犵犪犲犻狀犻狀犱狌狊狋狉犻犪犾犮犻狉犮狌犾犪狋犻狀犵犮狅狅犾犻狀犵狑犪狋犲狉 — 犘犪狉狋 ２ ： 犈狓犪犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狊狅犻犾犿犻犮狉狅犫犻狅狋犻 — 犛狋犪狀犱犪狉犱狅犳狆犾犪狋犲犮狅狌狀狋 ２００９  ０５  １８ 发布 ２０１０  ０２  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 ＧＢ ／ Ｔ１４６４３ 《 工业循环冷却水中菌藻的测定方法 》 分为以下几个部分 ： ——— 第 １ 部分 ： 黏液形成菌的测定 　 平皿计数法 ——— 第 ２ 部分 ： 土壤菌群的测定 　 平皿计数法 ——— 第 ３ 部分 ： 黏泥真菌的测定 　 平皿计数法 ——— 第 ４ 部分 ： 土壤真菌的测定 　 平皿计数法 ——— 第 ５ 部分 ： 硫酸盐还原菌的测定 　 ＭＰＮ 法 ——— 第 ６ 部分 ： 铁细菌的测定 　 ＭＰＮ 法 本部分为 ＧＢ ／ Ｔ１４６４３ 的第 ２ 部分 。 本部分代替 ＧＢ ／ Ｔ１４６４３．２ — １９９３ 《 工业循环冷却水中土壤菌群的测定 　 平皿计数法 》。 本部分与 ＧＢ ／ Ｔ１４６４３．２ — １９９３ 相比 ， 在技术内容上并无变化 ， 只是对文本结构和文字进行了 修改 。 本部分由中国石油和化学工业协会提出 。 本部分由全国化学标准化技术委员会水处理剂分会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ６３ ／ ＳＣ５ ） 归口 。 本部分负责起草单位 ： 中海油天津化工研究设计院 、 天津正达科技有限责任公司 。 本部分主要起草人 ： 李琳 、 张全 、 白莹 。 本部分于 １９９３ 年首次发布 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 １４６４３ ． ２ — ２００９ 工业循环冷却水中菌藻的测定方法 第 ２ 部分 ： 土壤菌群的测定 平皿计数法 １ 　 范围 ＧＢ ／ Ｔ１４６４３ 的本部分规定了工业循环冷却水中土壤菌群的测定方法 。 本部分适用于工业循环冷却水中土壤菌群的测定 ， 也适用于原水 、 生活用水及其他水中土壤菌群的 测定 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过 ＧＢ ／ Ｔ１４６４３ 的本部分的引用而成为本部分的条款 。 凡是注日期的引用文 件 ， 其随后所有的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本部分 ， 然而 ， 鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本 部分 。 ＧＢ ／ Ｔ６０３ 　 化学试剂 　 试验方法中所用制剂及制品的制备 （ ＧＢ ／ Ｔ６０３ — ２００２ ， ＩＳＯ６３５３１ ： １９８２ ， ＮＥＱ ） ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 （ ＧＢ ／ Ｔ６６８２ — ２００８ ， ＩＳＯ３６９６ ： １９８７ ， ＭＯＤ ） ３ 　 方法提要 本部分采用混合培养基 ， 利用平皿计数技术 ， 在 （ ２９±１ ） ℃ 培养 ７２ｈ ， 测定循环冷却水中土壤菌群 总数 。 ４ 　 试剂和材料 本部分所用试剂 ， 除非另有规定 ， 应使用分析纯试剂和符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 中三级水的规定 。 试验中所需制剂及制品 ， 在没有注明其他要求时 ， 均按 ＧＢ ／ Ｔ６０３ 之规定制备 。 ４ ． １ 　 牛肉膏 ： 生物试剂 。 ４ ． ２ 　 蛋白胨 ： 生物试剂 。 ４ ． ３ 　 琼脂 ： 生物试剂 。 ４ ． ４ 　 氯化钠 。 ４ ． ５ 　 硝酸钠 。 ４ ． ６ 　 磷酸氢二钾 。 ４ ． ７ 　 氯化钾 。 ４ ． ８ 　 硫酸镁 。 ４ ． ９ 　 硫酸亚铁 。 ４ ． １０ 　 蔗糖 。 ４ ． １１ 　 土壤 （ 果园土 、 菜园土 ）。 ４ ． １２ 　 氢氧化钠溶液 ： ４０ｇ ／ Ｌ 。 ４ ． １３ 　 乙醇溶液 ： ７５％ （ 体积分数 ）。 １ 犌犅 ／ 犜 １４６４３ ． ２ — ２００９ ４ ． １４ 　 硫代硫酸钠 。 ４ ． １５ 　 牛皮纸 。 ４ ． １６ 　 医用脱脂棉 。 ４ ． １７ 　 医用脱脂纱布 。 ５ 　 仪器 、 设备 ５ ． １ 　 无菌箱 （ 室 ） 或超净工作台 。 ５ ． ２ 　 蒸汽压力灭菌器 。 ５ ． ３ 　 生化培养箱 。 ５ ． ４ 　 鼓风电热干燥箱 ： 温度可控制在 ６０℃ ～ ２８０℃ 。 ５ ． ５ 　 铝锅 ：  ２００ｍｍ 。 ５ ． ６ 　 搪瓷量杯 ： １０００ｍＬ 。 ５ ． ７ 　 磨口三角瓶 ： １００ｍＬ 。 ５ ． ８ 　 培养皿 ：  ９０ｍｍ 。 ５ ． ９ 　 磨口试剂瓶 ： １０００ｍＬ 。 ５ ． １０ 　 刻度吸管 ： １ｍＬ 。 ５ ． １１ 　 刻度吸管 ： ５ｍＬ 。 ５ ． １２ 　 三角瓶 ： ５００ｍＬ 。 ６ 　 试验前的准备 ６ ． １ 　 土壤浸出液的制备 称取约 １００ｇ 土壤加入 ３００ｇ 水中 ， 采用蒸汽压力灭菌器在 （ １２１±１ ） ℃ 灭菌 １５ｍｉｎ ， 静置 ２４ｈ 后第 二次灭菌 ， 再静置 ２４ｈ 后进行第三次灭菌 。 瓶中的上层清液为土壤浸出液 。 ６ ． ２ 　 培养基的制备 称取下列试剂 ： 牛肉膏 ： １．５ｇ 。 蛋白胨 ： ５．０ｇ 。 氯化钠 ： ２．５ｇ 。 硝酸钠 ： ２．５ｇ 。 磷酸氢二钾 ： ０．５ｇ 。 氯化钾 ： ０．２ｇ 。 硫酸镁 ： ０．２５ｇ 。 硫酸亚铁 ： ０．００５ｇ 。 蔗糖 ： ２０．０ｇ 。 土壤浸出液 ： ５ｍＬ 。 琼脂 ： １５．０ｇ 。 将上述试剂加水约 ９５０ｍＬ ， 在电炉上加热溶解后 ， 趁热用四层医用脱脂纱布过滤于搪瓷量杯中 ， 用 热水补充至 １０００ｍＬ ， 用氢氧化钠溶液调节 ｐＨ 至 ７．０±０．２ ， 并分装在 ５００ｍＬ 三角瓶中 ， 每瓶分装量 不超过其总容量的 ２ ／ ３ 。 塞上棉塞 ， 用牛皮纸把瓶口包好 ， 用蒸汽压力灭菌器于 （ １２１±１ ） ℃ 灭菌 １５ｍｉｎ 。 ６ ． ３ 　 无菌稀释水的制备 ６ ． ３ ． １ 　 生理盐水的配制 ： 称取 ８．５ｇ 氯化钠 ， 溶解在 １０００ｍＬ 水中 ， 混匀 。 ２ 犌犅 ／ 犜 １４６４３ ． ２ — ２００９ ６ ． ３ ． ２ 　 将生理盐水分装在 １００ｍＬ 磨口三角瓶中 ， 每瓶 ４５ｍＬ ， 每个三角瓶塞子和瓶口间插入一小纸 片 ， 塞紧瓶塞 ， 每个瓶子的瓶口均用牛皮纸包扎以防污染 ， 用蒸汽压力灭菌器于 （ １２１±１ ） ℃ 灭菌 １５ｍｉｎ 。 ６ ． ４ 　 刻度吸管的灭菌 ６ ． ４ ． １ 　 将洗净并烘干后的吸管粗端塞上医用脱脂棉 ， 棉花量要适宜 ， 长度大约 １０ｍｍ ～ １５ｍｍ ， 棉花不 宜露在口外 ， 多余的棉花可以用火焰烧掉 。 ６ ． ４ ． ２ 　 每支刻度吸管用 １ 条约 ４０ｍｍ ～ ５０ｍｍ 宽的牛皮纸条 ， 以 ４５° 左右角度螺旋形卷起来 ， 吸管的 尖端在头部 ， 粗端用多余的纸条折叠打结 ， 不使散开 ， 标上量度 ， 若干支扎成一束 ， 置电热干燥箱中 ， 于 （ １６０±２ ） ℃ 灭菌 ２ｈ 。 ６ ． ５ 　 培养皿的灭菌 将洗净并烘干后的培养皿 １０ 个左右叠在一起 ， 用牛皮纸卷成一筒 ， 置电热干燥箱中于 （ １６０±２ ） ℃ 灭菌 ２ｈ 。 ６ ． ６ 　 采样瓶的灭菌 将洗净并烘干后的 １０００ｍＬ 磨口试剂瓶瓶口和瓶颈用牛皮纸裹好 ， 扎紧 ， 置电热干燥箱于 （ １６０±２ ） ℃ 灭菌 ２ｈ 。 ６ ． ７ 　 硫代硫酸钠灭菌 将硫代硫酸钠放入无菌箱 （ 室 ） 内 ， 并均匀地摊在离紫外线灯 ３０ｃｍ 处 ， 灭菌 ３０ｍｉｎ 。 ７ 　 测定步骤 ７ ． １ 　 水样的采集 ７ ． １ ． １ 　 用无菌采样瓶采集被测样品 ， 在采样过程中 ， 要保护瓶口和瓶颈 ， 防止这些部分受杂菌污染 。 瓶 内要留下足够的空间 ， 以备测定之前摇晃 。 ７ ． １ ． ２ 　 若采集的水中有余氯 ， 应于采样前在无菌操作下于无菌采样瓶中加入灭过菌的硫代硫酸钠 ， 加 入量为每升水样约 ０．１ｇ 。 ７ ． １ ． ３ 　 水样采集后应立即进行测定 ， 如果 ２ｈ 内不能进行测定 ， 应把水样放在冰箱中 ， 于 ４℃ ～ １０℃ 保存 ， 保存时间不宜超过 ２４ｈ 。 经冷冻保存后的水样需测定时 ， 从冰箱中取出于 ３０℃ 左右活化 ４ｈ ～ ５ｈ ， 再进行测定 。 ７ ． ２ 　 无菌箱 （ 室 ） 灭菌 ７ ． ２ ． １ 　 把实验所用的无菌稀释水 、 无菌培养皿 、 无菌吸管等用品放入无菌箱 （ 室 ） 内 ， 打开紫外线灯灭菌 ３０ｍｉｎ 。 ７ ． ３ 　 水样的稀释和接种 ７ ． ３ ． １ 　 关掉紫外线灯 ， 打开荧光灯 ， 将待测水样放入无菌箱 （ 室 ） 中 ， 立即用 ７５％ 的乙醇溶液浸泡的医 用脱脂棉球擦手 ， 点燃无菌箱 （ 室 ） 内的酒精灯 。 以下对水样的稀释和接种条的操作应在无菌箱 （ 室 ） 内的火焰区进行 。 ７ ． ３ ． ２ 　 选择适宜的稀释度 ， 应使最后一个稀释度接种后培养皿中生长的菌落数小