SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2856—2011 非洲马瘟检疫技术规范 Quarantine protocol for African horse sickness 行业标准信息服务平台 2011-05-31发布 2011-12-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2856—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 诊断技术”。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫 局、中华人民共和国云南出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：邓明俊、肖西志、朱来华、凌宗帅、郑小龙、孙敏、梁成珠、花群义、周晓黎、 高志强。 行业标准信息服务平台 SN/T2856—2011 非洲马瘟检疫技术规范 1范围 本标准规定了非洲马瘟的临床诊断要点、非洲马瘟实验室病毒分离技术、反转录聚合酶链式反应技 术（RT-PCR）、实时荧光RT-PCR检测技术、RT-PCR分型鉴定技术、血清中和试验（SNT）、酶联免疫吸 附试验（ELISA)等实验室操作的技术要求。 本标准适用于进出口马、驴、骤等马属动物非洲马瘟的检疫、诊断和血清学调查。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB16548病害动物和病害动物产品生物安全处理规程 GB/T18088出人境动物检疫采样 GB19489实验室生物安全通用要求 3临床诊断 3.1 发病症状 首先使个体或群体马保持安静，观察其精神状态、呼吸状况、站立姿势；注意观察头部、颜面及体表 是否出现特征性水肿。其次，观察马匹运动状况，是否有行动迟缓、行为异常等现象。在临床诊断观察 中应重点注意以下几点： 困难,在数小时内突然死亡： b) 液体； c) 马匹呈现急性发热或弛张型发热，持续1d~2d或5d～8d，最高体温可达40℃～41℃： d) 服务平台 可扩展到颈部至胸部； e) 结膜和舌腹侧以及皮下有出血点； f）厌食和精神抑郁，有的烦躁不安，表现出类似疝痛症状， 非洲马瘟相关资料参见附录A。 3.2 病理变化 病理剖检应注意观察以下要点： a）项韧带水肿； b) 畜体肌肉间隙水肿并呈胶冻样； c) 多处组织淤血并形成大量淤斑； 1 SN/T 2856—2011 d) 肺部组织水肿（近一半感染动物出现这一特征）； e) 皮下组织呈现黄色胶冻样水肿； f) 心包积水、体内大量腹水； 盲肠和结肠浆膜表面有很多点状出血。 4实验室诊断 4.1病毒分离鉴定 注：非洲马瘟病毒分离操作过程应该在具有三级生物安全的实验室内完成。 4.1.1试剂与材料 4.1.1.1Vero细胞或BHK-21细胞。 4.1.1.2RPMI1640培养基或其他等效培养基。 4.1.1.3胎牛血清。 4.1.1.4青霉素、链霉素。 4.1.1.5 肝素。 4. 1. 1. 6 各种常规试剂及细胞培养相关耗材。 4. 1. 2 设备 4. 1. 2. 1 超净工作台或生物安全柜。 4.1.2.2 高速冷冻离心机。 4. 1. 2. 3 倒置光学显微镜。 4. 1. 2. 4 二氧化碳细胞培养箱。 4. 1.2.5 高压灭菌锅。 4.1.3样品采集 4.1.3. 1 血液样品 颈静脉无菌采集动物的肝素抗凝血，置一20℃保存备用。 4. 1. 3. 2 组织样品 无菌采集动物的脾、肺、淋巴结等组织，保温盒加冰冷藏保存，迅速送往指定的实验室。若需长期保 存,置一70℃。 4.1.4组织样品的前处理 取采集的组织2g4g，以pH7.2的PBS液将其研磨成10%的悬液。悬液中加人青霉素（终浓度 为100IU/mL）、链霉素（终浓度为100μg/mL），1000r/min离心10min.收取上清液一5℃～一30℃ 保存备用。 4.1.5病毒增殖 4.1.5.1血样 培养状态良好的Vero细胞或BHK-21细胞。无菌抗凝血样勿需稀释可直接用于接种细胞：取适 量血样样品接种单层细胞，37℃吸附60min。充分洗涤后加维持液，置37℃5%二氧化碳培养箱培养。 血液样品也可先用pH7.2的PBS液或细胞培养液洗涤两次，然后反复冻融（充分裂解，以排除血 2