ICS 65.020.30 CCS ZJSC B50 团体 标准 T/ZJSC 0013—2025 沼虾黄病毒检测方法 Detection methods for Macrobrachium Flavivirus 2025 - 03 - 11发布 2025 - 04 - 11实施 浙江省水产学会 发布 全国团体标准信息平台 T/ZJSC 0013 —2025 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由浙江省水产学会提出并归口。 本文件起草单位：浙江省淡水水产研究所。 本文件主要起草人：潘晓艺、蔺凌云、沈锦玉、张海琪、王甘翔、袁雪梅、姚嘉赟、黄雷、陈静、 步夏莲、彭先启、尹文林、黄小红。 全国团体标准信息平台 T/ZJSC 0013 —2025 2 沼虾黄病毒检测方法 1 范围 本文件描述了试剂和材料、仪器设备，采样、 RNA提取、套式 RT-PCR检测、RT-qPCR检测、RT-LAMP 检测以及综合判定的方法。 本文件适用于沼虾黄病毒的流行病学调查、检测和监测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 沼虾黄病毒 macrobrachium flavivirus, MFV 罗氏沼虾铁虾综合症的主要病毒性病原，病毒粒子为 具囊膜的直径约 55 nm的球形颗粒，核酸类型 为单股正链 RNA，长度约 12.57 kb，又称传染性早熟病毒（ Infectious Precocity virus ，IPV），为黄 病毒科（ Flaviviridae ）成员。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BHQ1：淬灭剂（ black hole quencher 1） bp：碱基对（ base pair ） DEPC：焦乙酸二乙酯（ diethyl pyrocarbonate ） DNA：脱氧核糖核酸（ deoxyribonucleic acid ） dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸混合物（ deoxy-ribonucleoside triphosphate mixture） FAM：羧基荧光素（ carboxyfluorescein ） IPV: 传染性早熟病毒（ infectious precocity virus ） MFV：沼虾黄病毒（ Macrobrachium Flavivirus ） M-MLV：莫洛尼鼠白血病病毒（ Moloney murine leukemia virus ） RdRp：RNA依赖的RNA聚合酶（ RNA-dependent RNA polymerase ） RNA：核糖核酸（ ribonucleic acid ） RNasin：核糖核酸酶抑制剂（ RNase inhibitor ） RT-LAMP：逆转录环介导等温扩增（ reverse transcription loop -mediated isothermal amplification ） RT-PCR：逆转录PCR（reverse transcription PCR） RT-qPCR：逆转录实时荧光定量 PCR（reverse transcription quantitative real -time PCR ） Taq：水生噬热杆菌（ Thermus aquaticus ） 全国团体标准信息平台 T/ZJSC 0013 —2025 3 5 试剂和材料 除非另有说明 ,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 5.1 氯仿。 5.2 异丙醇。 5.3 无水乙醇。 5.4 TRIzol试剂：商品化试剂， 4 ℃保存。 5.5 dNTPs：商品化试剂，含 dATP、dTTP、dGTP、dCTP各10 mmol/L的混合物， -20 ℃保存。 5.6 RNasin（40 U/μL）：商品化试剂， -20 ℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。 5.7 M-MLV逆转录酶（ 200 U/μL）：商品化试剂， -20 ℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。 5.8 5 × M-MLV逆转录酶缓冲液：商品化试剂， -20 ℃保存。 5.9 10 × PCR缓冲液：不含 Mg2+，-20 ℃保存。 5.10 MgCl 2：25 mmol/L，-20 ℃保存。 5.11 Taq DNA聚合酶：商品化试剂， 5 U/μL，-20 ℃保存。 5.12 琼脂糖电泳核酸染料： 商品化试剂。 5.13 DNA分子量标准： DNA Marker DL2000 ，-20 ℃保存。 5.14 Hot-Start Taq DNA聚合酶（ 5 U/μL）：商品化试剂， -20 ℃保存。 5.15 Bst 3.0 DNA 聚合酶（ 8 U/μL）：商品化试剂， -20 ℃保存。 5.16 AMV反转录酶（ 5 U/μL）：商品化试剂， -20 ℃保存。 5.17 SYTO 9绿色荧光核酸染料（ 5 mM）：商品化试剂， -20 ℃保存。 5.18 琼脂糖：电泳级。 5.19 MFV套式PCR引物：引物浓度为 10 μmol/L，-20 ℃保存。第一轮 PCR引物分别是 MFV533F1 和 MFV533R1 ，扩增MFV 5NTR基因中的 533 bp片段（见附录 B.1）；第二轮 PCR引物分别是 MFV474F2 和 MFV474R2 ，从上述片段中再扩增 474 bp的片段。引物序列如下： a) MFV-533F1：5′-GAAGTCAGAGCGACAGCGAG -3′； b) MFV-533R1：5′-TGGGCGATCCCTCCTGTTT -3′； c) MFV-474F2：5′-TTGGGTTTGTTTGAGGTGTGAA -3′； d) MFV-474R2：5′-CCTCCTGTTTCGATGACTAGCA -3′。 5.20 MFV荧光定量 PCR引物：引物和探针浓度为 10 μmol/L，-20 ℃保存。 扩增引物 分别是MFV-Tq140F 和MFV-Tq140R，扩增MFV E基因中的140 bp片段（见附录 B.2）；探针MFV-TqMAN。引物、探针序列如 下： a) MFV-Tq140F：5′-AGGAGAGGGTTTTGGCTTG -3′； b) MFV-Tq140R：5′-CTGGATTGGAAGGGAACTCTG -3′； c) MFV-TqMAN：5′-6-FAM-CCGCGACACTTACAACTGCCCTT -BHQ1-3′。 5.21 MFV RT-LAMP引物：配制引物预混液，各 引物终浓度分别为MFV-FIP、MFV-BIP：16 μmol/L，MFV- F3、MFV-B3：2 μmol/L，MFV-LpF：8 μmol/L，-20 ℃保存。引物组扩增MFV NS基因的236 bp片段（见 附录B.3）；引物序列如下： MFV-FIP：5′-CCTCCTGTGCTTCACTATGACTTTAGACAGCCTCTATCTACTTC -3′； MFV-BIP：5′-GATATCACGGACGGCGAGTTTATAGCATCAGACAGCGAT -3′； MFV-F3：5′-GAACCAGTGACTAGACCA -3′； MFV-B3：5′-TCTGTCATCACATCCACA -3′； MFV-LpF：5′-TGTGACAATCGCCATAACA -3′。 5.22 阳性对照：受 MFV感染且RT-PCR结果显示强阳性的虾组织， -80 ℃保存。 5.23 阴性对照：未受 MFV感染且RT-PCR结果显示阴性的虾组织， -80 ℃保存。 5.24 空白对照：无 RNA酶的水。 6 仪器设备 6.1 普通冰箱。 6.2 超低温冰箱： -80 ℃。 全国团体标准信息平台