ICS 65.020.30 B 40 备案号：35741-2013 吉 林 DB22 省 地 方 标 准 DB 22/T 1607—2012 化妆品中单核细胞增生李斯特氏菌检测 Detection of listeria monocytogenes in cosmetics 2012 - 12 - 01 发布 吉林省质量技术监督局 2013 - 01 - 01 实施 发 布 DB22/T 1607—2012 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。 本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口。 本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心。 本标准主要起草人：孟日增、王宁、丁旭、刘韬、宋战均、刘金华、蔡阳、罗雁非。 I DB22/T 1607—2012 化妆品中单核细胞增生李斯特氏菌检测 1 范围 本标准规定了单核细胞增生李斯特氏菌的检测方法。 本标准适用于化妆品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 7918.1 化妆品微生物标准检验方法 总则 3 试剂和材料 3.1 水：为符合 GB/T 6682 的灭菌二级水。 3.2 Half-Fraser 培养基：见附录 A.1。 3.3 Fraser 肉汤：见附录 A.2。 3.4 牛津琼脂（Oxford 琼脂）：见附录 A.3。 3.5 ALOA 琼脂：见附录 A.4。 3.6 胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂(TSA-YE) ：见附录 A.5。 3.7 胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤(TSB-YE) ：见附录 A.6。 3.8 绵羊血琼脂：见附录 A.7。 3.9 糖类利用肉汤（鼠李糖和木糖）：见附录 A.8。 3.10 CAMP（Christle，Atkins，Munch-Petersen）培养基及试验菌株：见附录 A.9。 3.11 过氧化氢溶液：见附录 A.10。 3.12 磷酸盐缓冲液（PBS）：见附录 A.11。 4 仪器和设备 4.1 恒温培养箱：25 ℃±1 ℃，30 ℃±1 ℃，35 ℃±1 ℃。 4.2 恒温水浴锅：46 ℃±1 ℃。 1 DB22/T 1607—2012 4.3 均质器或灭菌乳钵。 4.4 显微镜：10X～100X。 4.5 接种环、接种针。 4.6 灭菌试管：18 mm～180 mm。 4.7 灭菌吸管：10 mL（具有 0.1 mL 刻度）和 1 mL（具有 0.1 mL 刻度）。 4.8 灭菌量筒： 容量 100 mL 和 250 mL。 4.9 灭菌培养皿：直径 90 mm～100 mm。 5 检验程序 单核细胞增生李斯特氏菌检测程序见图1。 检样（10 mL） ＋ 初次增菌培养基（Half-Fraser 90 mL） 30 ℃±1 ℃培养 24 h±2 h 二次增菌培养基（Fraser 10 mL） 35 ℃±1 ℃培养 48 h±2 h 选择性分离培养基（牛津、ALOA） 选择性分离培养基（牛津、ALOA） 35 ℃±1 ℃培养 48 h±2 h 接种木糖、鼠李糖 35 ℃±1 ℃培养 24 h±2 h 35 ℃±1 ℃培养 48 h±2 h 木糖-，鼠李糖+ 接种木糖、鼠李糖 35 ℃±1 ℃培养 24 h±2 h 木糖-，鼠李糖+ 纯化、鉴定 纯化、鉴定 图 1 单核细胞增生李斯特氏菌检测程序 2 DB22/T 1607—2012 6 操作步骤 6.1 样品稀释液制备 按照 GB 7918.1 中的规定执行。 6.2 增菌培养 初次增菌，取 1:10 样品稀释液 10 mL 加到 90 ml Half-Fraser 液体培养基中，置 30 ℃±1 ℃培养 24 h±2 h。二次增菌，取 0.1 mL 初次增菌的培养物，加入到 10 mL Fraser 培养液中，置 35 ℃±1 ℃培养 48 h±2 h。 6.3 分离培养 用接种环取培养过的 Half-Fraser 增菌液的表层培养物划线接种于牛津琼脂和 ALOA 琼脂两种选择 性平板上。将二次增菌培养物按同样步骤，划线接种于牛津琼脂和 ALOA 琼脂选择性平板上。置 35 ℃ ±1 ℃培养 48 h±2 h。经 48 h 恒温培养后，检查平板上有无可疑单核细胞增生李斯特氏菌菌落。培养 24 h 的典型李斯特氏菌在牛津琼脂上为细小（1 mm）的灰色菌落，其外围有黑色晕圈，48 h 后菌落变暗， 可见绿色光泽，直径约 2 mm，有黑色的晕圈并且中间凹陷。典型单核细胞增生李斯特氏菌在 ALOA 琼 脂上为蓝绿色菌落，颜色较为鲜艳，菌落直径 1 mm，菌落较小，圆形规则，边缘整齐，有较为明显不 透明晕圈。 6.4 糖发酵反应 从每种选择性培养基的每一平板中选择5个以上疑似单核细胞增生李斯特氏菌的菌落。如果一只平 板中少于5个疑似菌落，须确挑去所有菌落，分别接种在木糖和鼠李糖发酵管中35 ℃±1 ℃培养24 h ±2 h；同时在TSA-YE上划线纯化，置30 ℃±1 ℃培养24 h～48 h。选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培 养物继续进行鉴定。 6.5 鉴定 6.5.1 纯培养 6.4 中纯化培养的 TSA-YE 平板。 6.5.2 过氧化氢酶试验 在 TSA-YE 琼脂平板中取单个菌落，悬浮于玻片上一滴过氧化氢溶液中产气泡者为阳性反应。 6.5.3 革兰氏染色 从 TSA-YE 琼脂平板中取单个菌落进行革兰氏染色，单核细胞增生李斯特氏菌为革兰氏阳性，狭 长短棒状；用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌呈现轻微旋转或翻滚样运动。 6.5.4 协同溶血试验（CAMP） 在绵羊血平板上相对平行接种金黄色葡萄球菌和马红球菌培养物（R.equi） ，接种线必须窄而均匀， 可通过用接种环和金属线与琼脂平面呈直角的方向（垂直）接种而得。在它们两个培养物中间靠近 1 mm~2 mm 处垂直接种可疑的单核细胞增生李斯特氏菌，但不能与二者接触。几个试验菌株应该同时接 种于同一平板内。同样，垂直接种对照菌株（单核增生李斯特氏菌、西尔李斯特氏菌、英诺克李斯特氏 菌）。如果使用血琼脂，则需 35 ℃±1 ℃或 37 ℃±1 ℃培养 18 h-24 h。待验菌株与金黄色葡萄球菌和 3 DB22/T 1607—2012 马红球菌间β-溶血作用增强者均可认为是阳性反应。单核细胞增生李斯特氏菌或西尔李斯特氏菌在靠 近金黄色葡萄球菌接种点附近的溶血增强，绵羊李斯特氏菌在靠近马红菌接种点附近的溶血增强，可见 明显的箭头状溶血现象，其他单核细胞增生李斯特氏菌不产生溶血现象。 6.5.5 生化鉴定 将上述可疑菌做进一步的生化实验，单核细胞增生李斯特氏菌与其它李斯特氏菌的区别见表 1。如 果选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据 6.4.1 的初步判断结果，从营养琼脂平板 上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定 系统进行鉴定。 表1 单核细胞增生李斯特氏菌菌种鉴定的反应特征 产酸 种类 单核细胞增生李斯特氏菌 L.monocytohenes 英诺克李斯特氏菌 L.innocua 绵羊李斯特氏菌 L.iuanuii 西尔李斯特氏菌 L.seeligeri 威尔斯李斯特氏菌 L. welshimeri 格氏李斯特氏菌 L.grayi 墨氏李斯特氏菌 L.murrayi CAMP 试验 溶血性 鼠李糖 木糖 金黄色葡萄球菌 马红球菌 + + - + - - V - - - + - + - + （-） - + （+） - - V + - - - - - - - - V - - - 注：V 为反应不定， （+）为 弱性反应， +为＞90%阳性反应，-为无反应。 7 检验结果报告 综合 6.5 中的结果，报告 10 g（mL）样品中检出或未检出单核细胞增生李斯特氏菌。 4 DB22/T 1607—2012 AA 附 录 A （规范性附录） 培养基 A.1 Half-Fraser肉汤 A.1.1 基本成份 A.1.1.1 成份 酪胨 胰蛋白胨 牛肉浸膏 酵母浸膏 氯化钠 磷酸氢二钠 磷酸二氢钠 七叶苷 水 5.0 g 5.0 g 5.0 g 5.0 g 20.0 g 12.0 g 1.35 g 1.0 g 1000 mL A.1.1.2 制备 将以上组份加热溶解，调节 pH 值至 7.2～7.4，分装，121 ℃高压灭菌 15min。 A.1.2 氯化锂溶液 A.1.2.1 成份 氯化锂 水 3.0 g 10 mL A.1.2.2 制备 将氯化锂加入水中，过滤除菌。 注意：溶解氯化锂时一定要做好预防措施，因为该反应大量热且对粘膜有刺激作用。 A.1.3 萘啶酸钠溶液 A.1.3.1 成份 萘啶酸钠 0.05 ml/L NaOH 溶液 0.1 g 10 mL A.1.3.2 制备 将萘啶酸钠溶解 NaOH 溶液中，过滤除菌。 A.1.4 盐酸吖碇黄素溶液 5 DB22/T 1607—2012 A.1.4.1 成份 盐酸吖碇黄素 水 A.1.4.2 0.25 g 100 mL 制备 将盐酸吖碇黄素溶于水中，过滤除菌。 A.1.5 柠檬酸铁（Ⅲ）铵 A.1.5.1 成份 柠檬酸铁（Ⅲ）铵 水 A.1.5.2 5.0 g 100 mL 成份 将柠檬酸铁（Ⅲ）铵溶于水中，过滤除菌。 A.1.6 全培养基 A.1.6.1 成份 基本成份（A.1.1） 氯化锂溶液（A.1.2） 萘啶酸钠溶液（A.1.3） 吖啶黄盐酸盐（A.1.4） 柠檬酸铁（Ⅲ）铵溶液（A.1.5） A.1.6.2 100 mL 1.0 mL 0.1 mL 0.5 mL 1.0 mL 制备 使用前，将上述四种溶液分别加入到 100 ml 的基本成份中去。 A.2 Fraser肉汤 A.2.1 基本成份 A.2.1.1 6 成份 酪胨 胰蛋白胨 牛肉浸膏 酵母浸膏 氯化钠 5.0 g 5.0 g 5.0 g 5.0 g 20.0 g 磷酸氢二钠 磷酸二氢钾 七叶苷 氯化锂 萘啶酸钠 12.0 g 1.35 g 1.0 g 3.0 g 0.02 g DB22/T 1607—2012 水 1000 mL A.2.1.2 制备 将以上组份加热溶解，调节 pH 值至 7