ICS 11.220 B 41 吉 DB22 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2010—2014 家畜（猪牛羊）戊型肝炎病毒的测定 RT-PCR 法 Detection of Hepatitis E virus by RT-PCR in Livestock（pig/cattle/sheep） 2014 - 02 - 28 发布 吉林省质量技术监督局 2014 - 04 - 30 实施 发 布 DB22/T 2010—2014 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。 本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院。 本标准主要起草人：苏双、邵洪泽、许志林、程荣华、王楠、李琳、毛文智、王忠国、李文东，于 丹。 1 DB22/T 2010—2014 家畜（猪牛羊）戊型肝炎病毒的测定 RT-PCR 法 警告─使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。 使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。 1 范围 本标准规定了家畜（猪牛羊）戊型肝炎病毒RT-PCR测定方法。 本标准适用于猪、牛、羊等家畜戊型肝炎病毒的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 戊型肝炎病毒 Hepatitis E virus [HEV] 戊型肝炎病毒科成员。一种单股正链RNA病毒，呈球形、直径27～34 nm，无囊膜，核衣壳呈二十 面体立体对称。病毒基因组长约7.2 knt，有3个开放阅读框（ORF1、ORF2、ORF3）。ORF2位于3′端， 为主要的结构基因编码区，可编码核衣壳蛋白。 3.2 聚合酶链反应 polymerase chain reaction [PCR] 聚合酶链反应（PCR）技术是一种在体外快速扩增特定 DNA 片段的方法。由热变性→复性→延伸 三步反应组成一个 PCR 循环，经过多次循环反应，使目的 DNA 得以大量扩增。 3.3 反转录 reverse transcription [RT] 反转录（RT）是以RNA为模板合成互补DNA（cDNA）的过程。 4 试剂与材料 4.1 引物 2 DB22/T 2010—2014 引物序列见表1，引物浓度为25 mmol/L。 表1 特异性引物序列 引物种类 引物名称 特异性引物的核苷酸序列 外引物 HEV-1 5'-TAY CGH AAY CAA GGH TGG CG-3' （第 1 次 PCR 引物） HEV-2 5'-TGY TGG TTR TCR TAR TCC TG -3' 内引物 HEV-3 5'-ATW CAT GGV TCR CCT GTG AA -3' （第 2 次 PCR 引物） HEV-4 5'-AAA TYA ATT CTG TCG GRA GC -3' 扩增片段长度（bp） 524 328 注：R=A/G，Y=C/T，W= A/T，H= A/C/T，V=A/C/G。 4.2 试剂 4.2.1 RNA 提取试剂盒 4.2.2 RT-PCR 试剂盒 4.2.3 DNA 分子质量标准（DNA Marker） DNA 分子质量标准可采用 100 bp DNA ladder Maker、DNA Marker DL 2 000 或其它等效产品。 4.2.4 其它试剂 4.2.4.1 4.2.4.2 4.2.4.3 4.2.4.4 4.2.4.5 4.2.4.6 4.2.4.7 双蒸水：符合 GB/T 6682 中 4.2 二级水要求； 0.1% DEPC 水：见附录 A 中 A.1； 75%无水乙醇：见附录 A 中 A.2； 10 mg/mL 溴化乙锭（EB）或其替代品：见附录 A 中 A.3； 凝胶加样缓冲液：见附录 A 中 A.4； 1 倍 Tris-硼酸电泳缓冲液：见附录 A 中 A.5； 灭菌 1 mol/L 磷酸缓冲盐溶液（PBS）：见附录 A 中 A.6。 4.3 材料 4.3.1 4.3.2 4.3.3 4.3.4 4.3.5 4.3.6 4.3.7 4.3.8 4.3.9 4.3.10 5 一次性无菌手套或乳胶手套； 1.5 mL 离心管； 0.2 mL PCR 反应管； 琼脂糖； 500 mL 量筒； 500 mL 锥形瓶； 吸头； 眼科剪； 眼科镊； 称量纸。 仪器设备 5.1 PCR 仪； 5.2 电泳仪； 3 DB22/T 2010—2014 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 5.11 5.12 5.13 6 电泳槽； 紫外光透射仪或凝胶成像系统； 高速台式冷冻离心机：12 000 r/min； 微型高速离心机：12 000 r/min； 水浴锅：30-100℃； 分析天平：感量 0.1 g； 微波炉； -20℃冰箱； 旋涡振荡器； 乳钵或玻璃研磨器； 微量移液器。 样品的采集及处理 6.1 肝脏样品的采集及处理 采取肝脏样品约1.0~2.0 g，置于灭菌研钵中，充分研磨成匀浆，加入灭菌的1 mol/L PBS 溶液配 成1︰5乳悬液，反复冻融3次。4℃ 8 000 r/min离心5 min，收集上清液，供RNA抽提或者-20 ℃保存备 用。 6.2 粪便样品的采集及处理 挑取0.5~1.0 g粪便样品于1.5 mL离心管内，加入灭菌的1 mol/L PBS 溶液，旋涡震荡混匀，制备 成10%的粪便悬液，4℃ 8 000 r/min离心10 min，收集上清液，供RNA抽提或者-20 ℃保存备用。 6.3 阳性及阴性对照 6.3.1 阳性对照 用 HEV NNA-1株等参考株作为阳性对照样品。 6.3.2 阴性对照 用0.1%DEPC 水代替RNA作为阴性对照。 6.4 待检样品 RNA 提取 取上述处理好的样品100 µL于1.5 mL无RNA酶离心管中，每管加入1 000 µL Trizol试剂，混匀， 室温放置5 min；加入200 µL氯仿，混匀，室温放置5 min，4 ℃，12 000 r/min离心10 min。取上清 400 µL于一个新的无RNA酶离心管，加入40 µLRNA助沉剂，加入440 µL异丙醇，混匀，-20℃放置30 min， 4 ℃，12 000 r/min离心10 min。弃上清，沉淀用0.1% DEPC 水配置的75%乙醇洗涤两次，在生物安全 柜中通风晾干，加入25 µL 0.1% DEPC水溶解沉淀，获得的RNA样品可直接进行反转录（RT）或置-20 ℃ 以下保存，尽快使用。本操作应在一个无RNA酶（Rnase）的条件下进行。 7 RT-PCR 测定 7.1 RT 反应 4 DB22/T 2010—2014 在冰浴条件下，按下列试剂用量在 PCR 反应管中分别加入各成分： a) 待检样品 RNA：10 µL； b) 10 mmol/L dNTPs 混合物：2 µL，终浓度为 0.8 mmol/L； c) 25 mmol/L HEV 外下游引物（HEV-2）：1 µL，终浓度为 1.0 mmol/L。 加完试剂后瞬时离心混匀。72℃ 5min，冰浴 2min。取出后再依次加入下列试剂： d) 5×RT 缓冲液（RT Buffer）：5 µL，终浓度为 1 倍； e) 200 U/µL M-MuLV 反转录酶：1 µL，终浓度为 8 U/µL； f) 40 U/µL RNA 酶抑制剂：1 µL，终浓度为 1.6 U/µL； g) 0.1% DEPC 水：5µL。 反应总体积为25 µL。加完试剂后瞬时离心混匀。将PCR反应管置于PCR仪内，按如下程序进行RT反 应：42 ℃反应1h；然后95 ℃灭活反转录酶5 min。RT反应获得的cDNA 可直接进行PCR反应或置-20 ℃ 保 存备用。本加样操作应在一个无RNA酶（Rnase）的条件下进行。 7.2 外引物 PCR 扩增 7.2.1 扩增体系 在冰浴条件下，按下列试剂用量在PCR反应管中分别加入各成份： a) 灭菌双蒸水：15.7 µL； b) 10×PCR 缓冲液（PCR Buffer）：2.5 µL，终浓度为 1 倍； c) 20 mmol/L MgCl2：2.0 µL，终浓度为 1.6 mmol/L； d) 10 mmol/L dNTPs 混合物：0.5 µL，终浓度为 0.2 mmol/L； e) 25 mmol/L HEV 外引物（HEV-1/HEV-2）：各 0.5 µL，终浓度为 0.5 mmol/L； f) 5 u/µL Taq DNA 聚合酶：0.3 µL，终浓度为 0.06 u/µL； g) RT 反应产物（cDNA）：3 µL。 7.2.2 扩增条件 依次加入试剂后瞬时离心混匀。将PCR反应管置于PCR仪内，按如下反应程序进行PCR反应：94 ℃预 变性4 min；然后进入94 ℃变性40 s，53 ℃复性40 s，72 ℃延伸60 s的循环，共进行35个循环；72 ℃ 彻底延伸10 min；4 ℃保存。PCR产物用于下一轮内引物PCR反应。 7.3 内引物 PCR 扩增 7.3.1 扩增体系 在冰浴条件下，按下列试剂用量在 PCR 反应管中分别加入各成分： a) 灭菌双蒸水：15.7 µL； b) 10×PCR 缓冲液（PCR Buffer）：2.5 µL，终浓度为 1 倍； c) 20 mmol/L MgCl2：2.0 µL，终浓度为 1.6 mmol/L； d) 10 mmol/L dNTPs 混合物：0.5 µL，终浓度为 0.2 mmol/L； e) 25 mmol/L HEV 内引物（HEV-3/HEV-4）：各 0.5 µL，终浓度为 0.5 mmol/L； f) 5 u/µL Taq DNA 聚合酶：0.3 µL，终浓度为 0.06 u/µL； g) 第一次 PCR 产物：3 µL。 7.3.2 扩增条件 5 DB22/T 2010—2014 依次加入试剂后瞬时离心混匀。将PCR反应管置于PCR仪内，按如下反应程序进行PCR反应：94 ℃ 预 变性4 min；然后进入94 ℃变性50 s，53 ℃复性50 s，72 ℃延伸50 s的循环，共进行35个循环；72 ℃ 彻底延伸10 min；4 ℃保存。PCR 产物可直接进行琼脂糖凝胶电泳分析或置4 ℃保存备用。 7