ICS 67.120.30 B 50 吉 DB22 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 1978—2013 野鲤种质鉴定 微卫星法 Identification Specifications of Wild Carp Microsatellites Method 2013 - 12 - 18 发布 吉林省质量技术监督局 2013 - 12 - 31 实施 发 布 DB22/T 1978—2013 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。 本标准由吉林省水利厅提出并归口。 本标准起草单位：吉林省水产科学研究院。 本标准主要起草人：郑伟、闫春梅、毛瑞鑫、陈伟强、王战蔚、王文兰、杜晓燕、李忠强、李秀颖、 常淑芳、李永利。 I DB22/T 1978—2013 野鲤种质鉴定 微卫星法 1 范围 本标准规定了利用微卫星法进行野鲤种质鉴定技术的试验方法。 本标准适用于鲜活野鲤种质鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 微卫星 microsatelites 又称短串联重复序列或简单重复序列（short tandem repeats，STRs； simple repeats，SSRs），以2bp～ 6bp的短核苷酸序列为基本单位，呈串联重复状散在分布于生物体基因组中。 3.2 遗传距离 genetic distance 衡量群体间若干性状综合遗传差异大小的指标。按多元统计分析方法计算品种间多个性状基因型值 构成的多维空间的几何距离，就叫作群体间的遗传距离。主要的遗传距离分析方法有：Nei 氏标准遗传 距离（Nei’s standard genetic distance）。 4 原理 微卫星由核心序列和两侧的侧翼序列所构成，侧翼序列使微卫星特异地定位于染色体某一部位，核 心序列重复数的差异则形成微卫星高度的多态性。若某个体基因组中某个微卫星重复单位数相等，该个 体在该座位的基因型为纯合子，否则为杂合子。检测方法是针对微卫星两端的侧翼序列设计引物，对模 板DNA进行PCR扩增，根据结果判断个体基因型，进行统计分析。 5 试剂 5.1 除非另有说明，所用试剂均为分析纯。实验用水应符合 GB/T 6682 一级水的要求。 1 DB22/T 1978—2013 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 无水乙醇。 N, N, N¢, N¢—四甲基乙二胺（TEMED）：4 ℃保存。 Taq DNA 聚合酶：-20 ℃保存。 分子量标准(Markers)：DL 2000。 溴化乙锭（EB）。 琼脂糖。 Tris 饱和酚。 300 g/L 丙烯酰胺溶液：20 mL 水中融解 29 g 丙烯酰胺，1 g 甲叉双丙烯酰胺，定容至 100 mL，4℃ 保存。 5.10 5×Tris 硼酸 (5×TBE) 电泳缓冲液：Tris 27 g，硼酸 13.75 g，加蒸馏水 400 mL 溶解后，加入 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）10 mL，补充蒸馏水定容至 500 mL。 5.11 100 g/L 过硫酸铵：8 mL 水中溶解 1 g 过硫酸铵，加水至 10 mL，4 ℃保存，现用现配。 5.12 1 g/L 硝酸银（AgNO3 ）染色液：将 AgNO3 0.5 g 溶于超纯水 450 mL，加 ddH2O 定容至 500 mL， 棕色瓶中保存。 5.13 裂解液：5 g/L 十二烷基肌胺酸钠，10 mmol/L EDTA（pH 8.0），200 μg/mL 蛋白酶 K。 5.14 显色液：将 NaOH 10 g，无水 Na2CO3 0.2 g，甲醛 2 mL，溶解于适量蒸馏水中，并定容至 500 mL， 现用现配。 5.15 提取液：Tris 饱和酚+氯仿+异戊醇（25+24+1，体积比）。 5.16 5.17 5.18 5.19 5.20 6 乙醇溶液：乙醇+水（7+3，体积比）。 dNTP：四种脱氧核苷酸（4×dNTP）；保存条件为-20℃± 2 ℃。 阳性对照品：30 尾野鲤 DNA 提取物，用 TE（pH 8.0）溶解至 50 ng/µL，4 ℃保存备用。 阴性对照品：30 尾建鲤 DNA 提取物，用 TE（pH 8.0）溶解至 50 ng/µL，4 ℃保存备用。 微卫星引物：参见附录 A。 仪器 6.1 电子天平：精度 0.0001 g。 6.2 低温高速离心机：最大容量 30×1.5 ml，最高转速 15,300 rpm。 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 7 单道可调移液器：0.1-2.5 μl，2-20 μl，20-200 μl，100-1000 μl。 水浴恒温震荡器：温控范围 RT-100℃，控温精度 ±1℃。 紫外分光光度计：波长范围 190 nm -1100 nm，波长精度±0.8 nm。 PCR 仪:控温范围 4.0-99.9 ℃。 电泳仪。 凝胶成像分析系统。 取样 7.1 样本要求 用于试验的鲜活鲤鱼样本数量至少30尾。 7.2 试样制备 将活体中直接采集的鳞片或鳍条样品浸泡在乙醇溶液中，-20 ℃保存备用。 2 DB22/T 1978—2013 8 试验步骤 8.1 DNA 提取 取20 mg鳍条加入0.6 mL裂解液，55 ℃温育1-2 h，并不时轻摇至组织块完全消化，取上清液用提取 液抽提3次，加入无水乙醇1 ml 于 -20 ℃过夜沉淀，离心，弃去上清液，再用0 ℃ 预冷的乙醇溶液洗 涤1次，自然干燥后加50-100 μL 1×TE（pH 8.0）溶解DNA，4 ℃保存备用。 8.2 DNA 测定 8.2.1 DNA 纯度测定 吸取1-3 µL提取的DNA，用浓度10-20 g/L 琼脂糖凝胶100 V 电泳 30 min，检测所提取DNA的质量。 以DNA条带的分子量及有无拖尾为标准判断DNA的质量。 分别于260 nm波长和280 nm波长下测定产物（或产物稀释液）的紫外吸收值。确定A260／A280比值在 1.8-2.0范围内，方可正常进行后续实验。 8.2.2 DNA 浓度测定 取适量8.2.1测定后产物，于260 nm波长测定紫外吸收值，并根据公式(1)计算产物DNA浓度。 X = A260 ´ 稀释倍数 ................................(1) 0.020 ´ L 式中： X ——被测样品DNA浓度, 单位为微克每毫升（µg/mL）； A260 ——被测样品在260 nm检测波长下的吸光度值； L ——比色池厚度，单位为厘米（cm）； 稀释倍数——检测前DNA吸光度值达到允许范围0.1-0.8 时所需要稀释的倍数。 注：基因组DNA完成定量测试后，稀释到50 ng/µL备用。 8.3 微卫星引物配制 取附录A所列17种微卫星引物用水配制成浓度为50pmol溶液，4 ℃保存备用。 8.4 PCR 扩增 8.4.1 PCR 反应体系 PCR反应体积均为15 mL， PCR反应体系组成见表1。 3 DB22/T 1978—2013 表1 微卫星标记—PCR 反应体系 试剂 反应体系 PCR Buffer (10´) 1.5 mL 正向引物 (2 pmol/mL) 0.5 mL 反向引物 (2 pmol/mL) 0.5 mL dNTPs (25 mmol/L) 1.5 mL rTaq (5 U/mL) 0.1 mL 2 mL DNA (50 ng-100 ng) 8.9 mL 超纯水 8.4.2 PCR 反应程序 PCR反应程序见表2。 表2 微卫星标记——PCR 反应程序 阶 段 温 度 时 间 1 94 ℃ 4 min 94 ℃ 30 s 50 ℃–62 ℃ 40 s 72 ℃ 50 s 2 30 个循环 3 4 72 ℃ 10 min 4 ℃保存 8.5 PCR 产物的聚丙烯酰胺凝胶检测 8.5.1 制胶装置的准备 弹簧夹、干胶架、玻璃胶板和隔板、塑料封口槽、鲨鱼齿梳子、烧杯和搅棒。 4 DB22/T 1978—2013 8.5.2 胶板的安装 用去污剂溶液洗涤玻璃板和间隔片，然后自来水彻底冲洗，再用蒸馏水冲洗净。立放于一旁晾干， 确保玻璃板无水印。再将两片玻璃板（其中一片带凹口）左右侧边用间隔片间隔好，立于塑料封口槽里， 用弹簧夹将左右两边与干胶架夹在一起，将配好的琼脂糖胶液倒入胶版下方的塑料封口槽里，待琼脂糖 胶液凝固。 8.5.3 制胶 将配制的52 mL 300 g/L 丙烯酰胺溶液中加入40 mL 5×TBE和107 mL 蒸馏水，250 μL 过硫酸铵， 15 μL TEMED，用搅棒混匀溶液（不得有气泡），将制好的胶板斜放45度角，然后用玻棒引流缓缓灌 入上述胶液。立即在胶板上缘插入鲨鱼梳子，梳子两端插入面应等同，室温，等其聚合完毕后，立即使 用或保存于室温达24 h。 8.5.4 装胶 缓慢移去胶板底端的塑料封口槽，将胶板带凹口面向内装到电泳槽上，用弹簧夹夹紧胶模。用1× 缓冲液把电泳槽的上下槽加满，慢慢地从凝胶上移走梳子，用注射器冲洗胶的顶部。将电极与电泳装置 相连，在120 V 的恒定电压下预电泳20 min。 8.5.5 点样 按照扩增产物的量等比例加入上样缓冲液，吸取3 μL混合物依次点入凝胶样品槽中。当所有的样品 加完后，在预留的样品槽点入DL2000 markers，将电源连接，120 V 恒压电泳。 8.5.6 凝胶的分离、标识与固定标识操作规程 当指示剂跑到胶板底部时，结束电泳，将电源电压调至为“O”，再关闭电源开关。取下凝胶板，小 心去掉胶板两侧的隔板后在蒸馏水中轻轻撬开两片玻璃板取下凝胶，用蒸馏水洗胶30 s，再将凝胶置于 1 g/L 硝酸银染色液中染色10 min，倒去染色液，用蒸馏水洗胶1 min 后将凝胶置于显色液中显色15 s， 再换用新显色液显色至条带清晰，取出凝胶放入蒸馏水中停止显色。 8.5.7 拍照 显影结束后，利用凝胶成像系统或相机将聚丙烯酰胺凝胶拍照保存。 8.6 对照试验 分别取阴性对照品、阳性对照品2ul，按8.2～8.5步骤进行试验。 8.7 PCR 数据统计分析 8.7.1 数据统计 选择电泳后清晰的扩增位点进行数据统计。根据片段迁移位置的不同，分别统计出每个样品的基因 型（如AA，AB，