ICS 65.020.99 B 41 备案号：36029-2013 吉 林 DB22 省 地 方 标 准 DB 22/T 1738—2012 梅花鹿结核病、布鲁氏菌病、口蹄疫 免疫规程 Immune program for tuberculosis, neapolitan and foot-and-mouth disease of sika deer 2012 - 12 - 21 发布 吉林省质量技术监督局 2013 - 01 - 01 实施 发 布 DB22/T 1738—2012 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由长春市质量技术监督局提出。 本标准由吉林省畜牧业管理局归口。 本标准起草单位：长春市农业科学院。 本标准主要起草人：田来明、杜锐、邹春丽、时坤、赵立峰、张维珍、姜福子、郝明远、张庆双、 郑慧、夏超、王雨千。 I DB22/T 1738—2012 梅花鹿结核病、布鲁氏菌病、口蹄疫免疫规程 1 范围 本标准规定了梅花鹿结核病、布鲁氏菌病、口蹄疫的诊断、免疫、免疫期、不良反应及注意事项。 本标准适用于梅花鹿的结核病、布鲁氏菌病、口蹄疫疾病的免疫预防。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 18635 动物防疫－基本术语 GB/T 18935 口蹄疫诊断技术 3 术语和定义 GB/T 18635 界定的及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 结核病 tuberculosis 由结核分枝杆菌所引起的人畜和禽类共患的一种慢性传染病，其病理特点是在许多种组织器官形成 肉芽和干酪样、钙化结节病变。 3.2 布鲁氏菌病 neapolitan 由布鲁氏杆菌引起的人、畜共患的传染病。 3.3 口蹄疫 foot and mouth disease 俗名“口疮”、“蹄癀”，是偶蹄兽的一种急性发热性高度接触性的传染病。其临诊特征是在口腔 粘膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱和溃烂。 3.4 变态反应 allergy 机体对某些抗原物质发生的一种可导致生理功能紊乱或组织损伤的异常免疫反应。 4 结核病 1 DB22/T 1738—2012 4.1 诊断 采用鹿结核病变态反应（OT点眼法）和酶联免疫吸附试验(ELISA)联合诊断方法，参照附录A的规定 执行。 4.2 免疫 4.2.1 适用对象 鹿结核病免疫适用对象如下： ——结核病阴性鹿； ——3月龄之内仔鹿可直接接种。 4.2.2 疫苗 冻干皮内注射BCG。 4.2.3 接种方法 接种前用75 %酒精消毒接种部位，在颈部或臀部采用皮内或皮下接种均可。 4.2.4 用量 仔鹿、幼鹿和成鹿每头每次0.75 mg，用1 mL稀释液稀释后接种。 4.2.5 接种次数 4.2.5.1 4.2.5.2 5 阴性鹿实行二次接种，间隔时间一年。 仔鹿连续三年每年春季接种一次。 布鲁氏菌病 5.1 诊断 采用鹿布鲁氏菌病酶联免疫吸附试验(ELISA)诊断方法，应参照附录B的规定执行。 5.2 免疫 5.2.1 适用对象 布鲁氏菌病阴性鹿。 5.2.2 疫苗 布鲁氏菌病羊型5号弱毒冻干疫苗。 5.2.3 接种方法 第一年免疫为皮下注射，以后各年均采用饮水口服给苗。 5.2.4 用量 5.2.4.1 2 皮下注射 DB22/T 1738—2012 成年鹿、幼年鹿，按每头每次250亿活菌数皮下注射；哺乳期仔鹿每头每次30 亿～40 亿活菌数皮 下注射。 5.2.4.2 口服 成年、幼年鹿按每头每次饮用400 亿活菌数。 5.2.5 接种时间 每年11月份接种。 5.3 免疫期 一年。 5.4 注意事项 5.4.1 5.4.2 5.4.3 5.4.4 5.4.5 该疫苗为活菌疫苗，在运输和保存时不应受热。 疫苗不准与抗生素并用。 疫苗稀释后，应当天用完，隔日不准再用。 母鹿应在配种前一个月接种，公鹿应在性成熟前接种，老、弱、残及妊娠母鹿不宜接种。 饮水给苗严禁用热水稀释疫苗，混合要均匀，按 20 头鹿一群为宜，给苗前断水 6 h。 5.4.6 疫苗有一定残余毒力，工作人员接触易引起感染。使用时要注意人员保护，不准徒手搅拌疫苗。 5.4.7 工作人员应带手套、口罩、工作服和胶靴，用后消毒；饮水槽可日晒消毒；稀释和注射疫苗的 用具，用后一定煮沸消毒。 5.4.8 饮水免疫一定远离水源，禁止将疫苗倒入河水或溪水中，也不准在河水或溪水中洗涤接种疫苗 用具。 6 口蹄疫 6.1 诊断 应按照GB/T 18935的要求执行。 6.2 免疫 6.2.1 适用对象 3月龄以上的梅花鹿。 6.2.2 疫苗 口蹄疫O型、亚洲Ⅰ型二价灭活疫苗。 6.2.3 接种方法 采用二次免疫法，间隔时间20 d～30 d。颈部或臀部肌肉注射。 6.2.4 用量 2 mL/每头。 3 DB22/T 1738—2012 6.3 不良反应 6.3.1 一般性不良反应 注射部位肿胀，体温升高，食欲不振；1 d～2 d后反应逐渐消失。 6.3.2 严重不良反应 少数鹿只可出现急性过敏性反应，个别母鹿可能出现流产。对于出现急性过敏性反应的鹿采用肾上 腺素肌肉或静脉注射。 6.4 免疫期 6个月。 4 DB22/T 1738—2012 AA 附 录 A （规范性附录） 鹿结核病变态反应（OT 点眼法）和酶联免疫吸附试验（ELISA）联合诊断方法 A.1 变态反应（OT点眼法） A.1.1 点眼用结核菌素 旧牛型结核菌素（OT）。 A.1.2 点眼方法 采用一次二回点眼法，间隔3 d～5 d。 A.1.3 操作程序 A.1.3.1 将OT用注射用水作1:1稀释后使用。 A.1.3.2 在点眼前进行鹿只检查，无其他疫病者方可点眼。有眼病或失明者不宜点眼。 A.1.3.3 点眼时一般将菌素点于左眼，左眼有病者可点于右眼，但要做好标记和记录。 A.1.3.4 点眼量为每头鹿0.2 mL～0.3 mL（约3 滴～5 滴）。 A.1.3.5 点眼后将鹿放回原圈舍，防止惊群和日光直射。 A.1.3.6 阴雨或大风天不宜作点眼检查。 A.1.4 观察判定时间 点眼后3、6、9小时各观察一次。观察时要两眼对照，注意眼房分泌物的性质和数量，眼结膜和眼 睑有无肿胀，以及是否流泪等。 A.1.5 判定标准 A.1.5.1 阳性反应 在眼角或眼周围有黄白色脓性分泌物，大小在1 mm×10 mm（约一个大米粒大）者判为阳性；如分 泌物不明显，但有明显眼结膜充血，眼睑水肿和流泪者亦可判为阳性。 A.1.5.2 疑似反应 眼房分泌物呈灰白色半透明，大小在1 mm×10 mm（约一个大米粒大），但无明显眼睑水肿判为疑 似。 A.1.5.3 阴性反应 无任何反应或稍有眼睑水肿及浆液性眼房分泌者判为阴性。 A.1.5.4 两回点眼综合判定 5 DB22/T 1738—2012 对第一回点眼呈阴性或疑似反应的鹿，隔3 天～5 天在同一眼、同样量进行第二回点眼。两回均为 阴性者判为阴性；两回均为疑似者判为阳性；第一回疑似，第二回阴性者判为阴性；第一回阴性，第二 回疑似者，隔一个月后再进行一次检疫。根据反应酌定。 A.1.5.5 点眼适宜时间 A.1.5.5.1 春季3月～4月，秋季8月～10月为点眼最佳时间。 A.1.5.5.2 公鹿可结合锯茸进行点眼，母鹿可结合仔鹿断奶分群进行点眼。 A.2 酶联免疫吸附试验（ELISA） A.2.1 抗原 牛型结核菌素提纯蛋白衍生物（PPD）。 A.2.2 第二抗体 用鹿IgG免疫制备的兔抗鹿IgG，即成为HRP-IgG。 A.2.3 操作程序 A.2.3.1 抗原包被 每孔加抗原（20 μg/mL）0.1 mL。每板设抗原、抗体、酶结核物和空白对照。放37 ℃湿盒孵育3 h。 取出用洗液洗涤3 次，每次3 min。 A.2.3.2 加被检血清 每孔待检血清（1:100）0.1 ml，每份血清加两孔，并每板设标阳、标阴血清对照，放37 ℃湿盒孵 育1 h。取出洗液洗涤3次，每次3分钟。 A.2.3.3 加酶结合物 每孔加酶结合物（浓度试验前标定）0.1 mL，放37 ℃湿盒孵育1 h。取出洗液洗涤3次，每次3 min。 A.2.3.4 加底物（过氧化氢—邻苯二胺） 以过氧化氢—邻苯二胺为底物液，每孔加0.1 mL，放37 ℃湿盒孵育15 min，取出后终止反应。 A.2.3.5 终止反应 用 2 M H2SO4 作为终止液，每孔加 0.05 mL，终止其反应。 A.2.4 检测 用酶联免疫测定仪检测，放490 nm处，以空白调零，测定各孔OD值。 A.2.5 判定标准 以P/N﹥2为判定标准。确定其判定临界OD值为0.56。凡OD值等于或大于0.56者为阳性。 A.3 变态反应（OT点眼法）和酶联免疫吸附试验（ELISA）联合检疫判定 6 DB22/T 1738—2012 A.3.1 首先对被检疫鹿群进行结核菌素一次二回点眼。结核菌素阳性者判为结核病阳性鹿。对结核菌 素阴性者和可疑者，暂不作判定。 A.3.2 将结核菌素阴性鹿采血进行ELISA检查，ELISA阳性者判为结核病阳性鹿，ELISA阴性者判为结核 病阴性鹿（即点眼和ELISA双阴性鹿）。 A.3.3 对结核菌素点眼可疑反应鹿采血进行ELISA检测。ELISA阳性判为结核病阳性鹿；ELISA阴性者判 为结核病阴性鹿。 7 DB22/T 1738—2012 BB 附 录 B （规范性附录） 鹿布鲁氏菌病酶联免疫吸附试验(ELISA)诊断方法 B.1 抗原 用灭菌蒸馏水稀释布氏杆菌猪二号苗，并制成100 亿/毫升菌液，经反复冻融后，置超声波破碎器 中15 min，离心去沉淀，其上清液再用蒸馏水透析，浓缩至蛋白含量为3.0 µg/mL。 B.2 第二抗体 用鹿IgG免疫制备的兔抗鹿IgG，用辣根过氧化物酶（HRP）标定，成为HRP-IgG。 B.3 操作程序 B.3.1 抗原包被 将超抗抗原用包被液1:25倍稀释后，每孔加0.1 mL，同时设抗原、酶结合物和空白对照，置37 ℃ 温箱孵育3 h。 B.3.2 洗涤 取出反应板，甩去微孔中的抗原溶液，用pH 7.4 0.01 M的PBST加入各孔，室温下放置3 min后倒掉， 如此反复三次。 B.3.3 加被检血清 将被检血清按1:100倍稀释，每孔加0.1 mL，每份血清加两孔，并设阳性血清和阴性血清对照，置 37 ℃温箱中0.5 h后，取出反应板，甩去微孔中的血清。用pH 7.4 0.01 M的PBST加入各孔，室温下放 置3