ICS 07.100.30 B 20 吉 DB22 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2053—2014 饲料中构巢曲霉测定 实时荧光 PCR 方法 Determination of Aspergillus nidulans in feedstuffs Real-time PCR method 2014 - 02 - 28 发布 2014 - 04 - 30 实施 吉 林省质 量 技 术监 督 局 发 布 DB22/T 2053—2014 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。 本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。 本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、国家农业深加工产品质量监督检验中心、中华 人民共和国吉林出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：史艳宇、刘金华、王莹、郎乐、张庆波、韩冰雪、李媛媛、王庆峰。 I DB22/T 2053—2014 饲料中构巢曲霉测定 实时荧光 PCR 方法 1 范围 本标准规定了饲料中构巢曲霉的实时荧光PCR检验方法。 本标准适用于饲料中构巢曲霉的快速筛选检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 13092 饲料中霉菌总数的测定 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 实时荧光PCR real-time fluorescent PCR 实时荧光聚合酶链式反应。 3.2 Ct值 cycle threshold value 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 4 原理 对样品的培养物进行DNA提取，通过实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅曲线，从而对饲 料中的构巢曲霉进行快速检测。 5 试剂 除特别说明以外，所有试剂均为分析纯，水为按照GB/T 6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA 酶污染的容器分装。 5.1 引物及探针： a) 上游引物：5’-GGCTACACCGAGGACGACAT-3’ b) 下游引物：5’-CCCGCCTTAGCATCGAAGA-3’ 1 DB22/T 2053—2014 c) 探针：5’-FAM-TCAACGGTGACACCCGCTCTT-TAMRA-3’ 5.2 Taq DNA 聚合酶。 5.3 dNTP：dATP（deoxyadenosine triphosphate，脱氧腺苷三磷酸）、dGTP（deoxyguanosina triphosphate， 脱氧鸟苷三磷酸）、dCTP（deoxycytidine triphosphate，脱氧胞苷三磷酸）、dTTP（deoxythymidine triphosphate，脱氧胸苷三磷酸）。 5.4 真菌基因组 DNA 提取纯化试剂盒。 5.5 10×PCR 缓冲液：含 200 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），200 mmol/L 氯化钾（KCl），15 mmol/L 氯 化镁（MgCl2 ）。 5.6 高盐察氏培养基：按 GB/T 13092 规定。 5.7 构巢曲霉质控菌株：来源于正规菌种保藏机构的标准菌株。 6 仪器和设备 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 实时荧光 PCR 仪。 生物安全柜：AII 型。 霉菌培养箱。 离心机：转速≥12 000 r/min。 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.6 6.7 6.8 6.9 6.10 6.11 6.12 6.13 高压灭菌器。 恒温水浴锅。 天平：感量 0.1g。 移液器：0.2 μL～2 μL、2 μL～10 μL、20 μL～200 μL、100 μL～1 000 μL。 均质器或乳钵。 涡旋混合器 实时荧光 PCR 反应管。 离心管：1.5 mL。 7 检测步骤 7.1 样品制备与培养 参照GB/T 13092对样品进行制备与培养。 7.2 DNA 提取 7.2.1 DNA 模板制备 从培养平皿上刮取菌丝0. 2 g～0. 5 g于1.5 mL离心管，使用真菌基因组DNA提取试剂盒并按其说明 提取制备模板DNA。提取的DNA溶液可于-20 ℃保存。 7.2.2 DNA 浓度测定 取10 μ L DNA溶液加蒸馏水稀释至1 mL，使用核酸蛋白仪或紫外分光光度计分别检测260 nm和280 nm处的吸光值。DNA的浓度按照式（1）计算，当A260/A280比值在1.5～2.1之间时，适宜于PCR扩增。扩 增前将所有样品DNA调至10 ng/μ L～50 ng/μ L。 2 DB22/T 2053—2014 c= A ´ N ´ 50 .............................................................................................(1) 1000 式中： c—— DNA浓度，单位为纳克每微升（ng/μL）； A—— 260 nm处的吸光值； N—— 核酸稀释倍数。 7.3 实时荧光 PCR 检验 7.3.1 实时荧光 PCR 反应体系 10×PCR缓冲液2.5 μL、引物对（10 μmol/L）各1 μL、探针（10 μmol/L）1 μL、dNTP（10 mmol/L） 1 μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL、模板DNA 2 μL、用灭菌去离子水补足体积至25 μL。 7.3.2 实时荧光 PCR 反应条件 95 ℃预变性2 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火延伸1 min，同时收集FAM荧光，共进行40个循环， 反应产物可在4 ℃保存。 不同仪器、不同Taq DNA聚合酶可根据要求将反应条件做适当调整。 检验过程中分别设置空白对照、阴性对照、阳性对照。空白对照设为以无菌水代替DNA模板；阴 性对照采用非构巢曲霉DNA作为实时荧光PCR反应的模板；阳性对照采用构巢曲霉DNA作为实时荧光 PCR反应的模板。 8 结果判定与报告 8.1 质量控制 ——空白对照：无扩增曲线，Ct 值≥40.0； ——阴性对照：无扩增曲线，Ct 值≥40.0； ——阳性对照：出现典型的扩增曲线，Ct 值应≤35.0； 否则，视为无效。 8.2 结果判定和报告 ——Ct 值≥40.0，可判定样品实时荧光 PCR 结果为阴性，可直接报告未检出构巢曲霉； ——Ct 值≤35.0，可判定样品实时荧光 PCR 结果为阳性，按附录 A 进行确证。确证试验结果为构 巢曲霉，则报告检出构巢曲霉； ——35.0＜Ct 值＜40.0，此时应适当增加 DNA 模板量重做实时荧光 PCR 检测。重做结果 Ct 值≥40.0 者为阴性，报告未检出构巢曲霉。否则实时荧光 PCR 结果为阳性，按附录 A 进行确证。确证 试验结果为构巢曲霉，则报告检出构巢曲霉。 9 生物安全措施 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行检测，所有培养物和废弃物应小心处置， 并按GB/T 27403中的有关规定执行。 10 废弃物处理和防止污染的措施 3 DB22/T 2053—2014 10.1 10.2 4 检验过程中的废弃物需经 121 ℃高压灭菌处理至少 30 min 后再弃置。 检验过程中防止交叉污染的措施按照 GB/T 27403 执行。 DB22/T 2053—2014 AA 附 录 A （规范性附录） 构巢曲霉确证方法 A.1 设备 A.1.1 A.1.2 A.1.3 A.1.4 A.1.5 显微镜：10 ×～100 ×。 目镜测微计。 物镜测微计。 无菌接种罩。 放大镜。 A.1.6 A.1.7 A.1.8 A.1.9 A.1.10 A.1.11 滴瓶。 接种钩针。 分离针。 载玻片。 盖玻片：18 mm×18 mm。 灭菌刀子。 A.2 试剂 A.2.1 乳酸-苯酚液 苯酚10 g，乳酸（密度1.21 kg/m3）10 g，甘油20 g，蒸馏水10 mL。将苯酚在水中加热溶解，然后 加入乳酸及甘油。 A.3 操作步骤 A.3.1 制片 取载玻片加乳酸-苯酚液一滴，用接种针取一小块霉菌培养物（尽量是纯培养物），置乳酸-苯酚液 中，用两支分离针将培养物撕开成小块，切忌涂抹，以免破坏霉菌结构；然后加盖玻片，如有气泡，可 在酒精灯上加热排除。制片时最好是在接种罩内操作，以防孢子飞扬。 A.3.2 镜检 观察霉菌的菌丝和孢子的形态和特征、孢子的排列等，并做详细记录。 A.3.3 构巢曲霉形态特征 构巢曲霉菌落生长较快，14 d直径5 cm～6 cm，绒状，绿色，有的菌系由于产生较多的闭囊壳而显 现黄色，反面紫红色。分生孢子头短柱形，(40 µm～80 µm)×(25 µm～40 µm)。分生孢子梗极短，常弯 曲，一般75 µm～100 µm，近顶囊处直径3.5 µm～5 µm，褐色，壁光滑。顶囊半球形，直径8 µm～10 µm。 小梗双层，梗基 (5 µm～6 µm)×(2 µm～3 µm)，小梗（5 µm～6 µm）× (2 µm～2.5 µm)。分生孢子球形， 5 DB22/T 2053—2014 粗糙，直径3 µm～3.5 µm。闭囊壳球形，暗紫红色，直径135 µm～150 µm。子囊孢子双凸镜形，紫红 色，约5 µm×4 µm，有两个鸡冠状突起。闭囊壳外面包围着一层壳细胞，淡黄色，球形，壁厚，直径约 25 µm（见图1）。 A.4 报告 根据菌落形态及镜检结果，参照构巢曲霉的形态描述，确定是否为构巢曲霉。 图1 构巢曲霉 _________________________________ 6