ICS 11.220 B 41 吉 DB 22 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2015—2014 坏死梭杆菌检测 PCR 法 Determination of Fusobacterium necrophorum—Polymerase Chain Reaction 2014 - 02 - 28 发布 吉林省质量技术监督局 2014 - 04 - 30 实施 发 布 DB22/T 2015—2014 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009、 GB/T 20001.4—2001 给出的规则起草。 本标准由吉林省农业委员会提出，吉林省畜牧业管理局归口。 本标准起草单位：中国农业科学院特产研究所。 本标准主要起草人：陈立志、冯二凯、王秀东、刘晓颖、姚志利、王峰、王雷、司方方、范琳琳、 徐晶、姜英。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 I DB22/T 2015—2014 坏死梭杆菌检测 PCR 法 警告——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出所有可能的安全问 题，使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合管家有关法规规定的条件。 1 范围 本标准规定了坏死梭杆菌的聚合酶链反应（PCR）检测方法。 本标准适用于反刍动物坏死梭杆菌的检测和分型。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 WS/T 230 临床诊断中聚合酶链式反应（PCR）技术的应用 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 坏死梭杆菌 fusobacterium necrophorum 一种严格厌氧的革兰氏阴性多形态的条件致病杆菌。 3.2 PCR 聚合酶链反应 polymerase chain reaction 体外酶促合成特异性DNA片段的一种分子生物学实验方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸 三个步骤反复的热循环构成：即模板DNA先经高温变性成单链，在DNA聚合酶和适宜的温度下，两条引物 分别与两条模板DNA链上的一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酶的催化下以四种脱氧核苷三磷酸 （dNTPs）为底物，使退火引物得以延伸。如此反复，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩 增。 4 缩略语 DNA：脱氧核糖核酸 （deoxyribonucleosidea acid）。 dNTP: 脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosbate）。 EDTA : 乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid）。 1 DB22/T 2015—2014 5 原理 针对坏死梭杆菌白细胞毒素两亚种启动子的特异性区域基因序列设计引物，应用聚合酶链反应 （PCR）技术从临床疑似坏死杆菌病病料扩增特异性DNA片段，根据是否扩增特异性片断及片断大小对坏 死梭杆菌进行检测和分型。 6 试剂与材料 除非另有说明，所有的化学试剂均为分析纯。实验用水规格应符合GB/T 6682中二级水的规定 6.1 试剂 6.1.1 引物 上游引物：P1:5-GCTCTCCTGCTTGTTTATTTC-3 上游引物：P2:5-GATCTTTGTTGGAAGCGAGT-3 下游引物：P3:5-GCACGACAAACCAAATAGC-3 配制成10μmol/L，-20℃保存。 6.1.2 DNA 分子量标准：DL 2000。 6.1.3 细菌基因组 DNA 提取试剂盒。 6.1.4 dNTP 溶液，含 dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP，各 2.5 mnol/L。 6.1.5 DNA 聚合酶（5 U/μL）。 6.1.6 10×PCR buffer（不含氯化镁）（市售）： 100 mmol/L KCl, 160mmol/L (NH4)2SO4, 20 mmol/L MgSO4, 200 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8), 1% Triton X-100，1mg/mL BSA。 6.1.7 氯化镁（MgCl2）25mmol/L。 6.1.8 琼脂糖，电泳级。 1%琼脂糖凝胶的配制： 琼脂糖 1g TAE电泳缓冲液（50倍） 2mL 灭菌三蒸水 98mL 微波炉中完全融化，加溴化乙锭（EB）溶液5μL。 6.1.9 TE 缓冲液（1×）：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA。 6.1.10 溴化乙锭（10 mg/mL）：称量 100 mg 溴化乙锭溶解于 10 mL 水中，然后分装成 1mL/份，4℃ 避光保存。 6.1.11 50×TAE：称量 242.0 g Tris 溶于 700 mL 蒸馏水中，加入 57.1 mL 冰乙酸，100 mL 0.5mol/L EDTA（pH8.0）后定容至 1000 mL，使用时 50 倍稀释。 2 DB22/T 2015—2014 6.1.12 6×Loading Buffer (市售）: 含 0.25% 溴酚蓝，0.25% 二甲苯青 FF，30%甘油水溶液，4℃保存。 6.2 材料 6.2.1 6.2.2 6.2.3 6.2.4 6.2.5 6.2.6 7 仪器设备 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 7.10 8 离心管：1.5 mL。 吸头：1000μL。 吸头：200μL。 吸头：10μL。 PCR 反应管。 冰盒：12 孔×4 孔。 紫外分光光度计。 PCR 仪。 电子天平（感量±0.01g）。 紫外透射仪或凝胶成像系统。 离心机>12 000 r/min。 核酸电泳仪。 涡旋振荡器。 微量可调移液器：0.2 μL～2 μL，2 μL～20 μL，20 μL～200 μL，100 μL～1000 μL。 恒温水浴锅。 pH 计 样品 8.1 采集 用无菌棉拭子沾取疑似感染坏死梭杆菌的动物病灶的病健结合处的组织或脓汁，放入灭菌的冻存 管中，低温冷藏保存（0℃~4℃）备用。 8.2 处理 将采回病料使用200 µL TE悬浮，自然沉淀5 min，2000 r/min离心3 min，4000 r/min离心1 min； 吸取上清至另一灭菌EP管，12000 r/min离心5 min，弃上清；加200 µL TE重悬沉淀，12000 r/min离 心5 min，弃上清，洗三次；沉淀加200 µL TE重悬。 8.3 提取模版 DNA 按照细菌基因组试剂盒说明书提取坏死梭杆菌基因组DNA。 8.4 阳性与阴性对照 8.4.1 阳性对照： 坏死梭杆菌necrophorum亚种（ATCC 27852）基因组DNA；坏死梭杆菌funduliforme亚种（ATCC51357） 基因组DNA；按照基因组试剂盒说明书分别提取坏死梭杆菌necrophorum亚种（ATCC 27852）和坏死梭杆 菌funduliforme亚种（ATCC51357）基因组DNA。 3 DB22/T 2015—2014 8.4.2 隐性对照：灭菌水 9 检测 9.1 PCR 反应体系 表1 PCR 反应体系 单位为微升 成分 用量 Component dosage dNTP/（2.5 mM each） 2.0 ＋ 10×PCR Buffer/（Mg2 阴性） 2.5 引物 L7/(10 mM) 1.0 引物 L8 /(10 mM) 1.0 引物 L9/(10 mM) 1.0 Mg2//（25 mM） 3.5 DNA 模版 2.0 Taq 酶/（5 U/μL） 0.2 灭菌双蒸水 定容至 25.0 注：按照上述试剂顺序逐项加样至已编好号的0.2mL的PCR反应管中比，混匀后瞬离 9.2 PCR 反应程序 9.2.1 预变性 95℃，10 min； 9.2.2 循环扩增 94℃ 1 min，56℃ 50 s，72℃ 1 min，30个循环； 9.2.3 延伸 72℃，10 min。4℃保存。 9.3 扩增产物电泳 用TAE电泳缓冲液配制成1%琼脂糖平板（溴化乙锭终浓度0.5μg/mL）。将平板放入水平电泳槽中， 加入1×TAE电泳缓冲液刚刚高出凝胶表面，将PCR扩增产物6μL与6μL上样缓冲液混合，分别加入样品孔 中，取5μL DNA Marker DL2000加入到标准分子量对照孔内。5V/cm恒压电泳30-45min。 10 结果判定 4 DB22/T 2015—2014 用凝胶成像系统进行分析。在阴性和阳性对照成立情况下，若待检样品出现1 076 bp特异性片段， 即判定为Fnn亚型；出现809 bp特异性片段，即为Fnf亚型。必要时取PCR扩增产物进行测序，如果结果 与附录A参考序列比较，序列相似性在95%以上，可进一步确认待测样品结果为阳性（标准序列见附录A1、 A2）。 11 废弃物处理和防止污染的措施。 11.1 检测过程中的废弃物进行无害化处理。 11.2 检测过程中防止交叉污染的措施按照 WS/T 230 中污染的预防和控制规定执行。 5 DB22/T 2015—2014 附 录 A （资料性附录） 坏死梭杆菌亚型判定的特征性序列 A1. 坏死梭杆菌 Fnn 型白细胞毒素启动子区扩增片段序列： GCTTTCCTGCTTGTTTATTTCTCATGATCTTTTTGTTGTTCGAAATATTTGCGATAGAGTTTTGATTAT GAAAGAAGGGAAAATCATAGAAGAAGGAAAGAAAGAGGAAATCTTTAAAGCACCGAAAAAAGA GTATACTCAATTTTTGCTGGAAGTGAGTATGAGTTTTATATTTTGATATAAAATCGAATAAAAAGGTA TTTTTTTGAAGAAAGGAAGCTTATCTTAACATAGATTTAACATTTGATGTGATAGCATGAATTTAATA TAAAATGCTGAAAATGTATCTAAAAATAATATAAAAAGAACATTGTATTTCCATAAAAAAATATTTTT TTAAATAAATATTTTATATAAAAAAATAATTAAATTTAAACTAGACATACAATAAGAAATATGCTAATC TAATAACGCTTGATATTTTAAAAAAATTAAAAATCATGAATACAATAGATGTTTATATCATTTGAGCT TCTTTTTTGAAAAACAGGAATTGT