ICS 65.120 B 04 备案号：35746-2013 吉 林 DB22 省 地 方 标 准 DB 22/T 1618—2012 饲料中玉米赤霉烯酮的测定 液相色谱-质谱/质谱法 Determination of zearalenone in feeds——HPLC-MS/MS method 2012 - 12 - 01 发布 吉林省质量技术监督局 2013 - 01 - 01 实施 发 布 DB22/T 1618—2012 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。 本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口。 本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心、长春大成实业有限公司、吉林出入境 检验检疫局。 本标准主要起草人：康明芹、姚天玲、黄军生、梁红锐、杨帆、张勋、顾婷婷、刘友林。 I DB22/T 1618—2012 饲料中玉米赤霉烯酮的测定 液相色谱-质谱/质谱法 1 范围 本标准规定了饲料中玉米赤霉烯酮的液相色谱-质谱/质谱测定方法。 本标准适用于饲料中玉米赤霉烯酮的测定和确证。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 3 原理 试样用乙腈-水溶液提取，免疫亲和柱净化，液相色谱-质谱/质谱仪测定，外标法定量。 4 试剂与材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。 4.1 氯化钠(NaCl)。 4.2 三水乙酸铅(C4H6O4Pb·3H2O)。 4.3 乙腈（CH3CN）：色谱纯。 4.4 甲醇(CH3OH)：色谱纯。 4.5 甲酸（HCOOH）：纯度≥98%。 4.6 玉米赤霉烯酮标准物质（C18H22O5，CAS 号：17924-92-4）：纯度≥98%。 4.7 25 %乙酸铅溶液：称取 58 g 三水乙酸铅（4.2），用 142 mL 水溶解，混匀。 4.8 乙腈-水（65+35）：650 mL 乙腈和 350 mL 水混匀。 4.9 0.1 %甲酸溶液：取 1 mL 甲酸(4.5)，用水稀释并定容至 1 000 mL。 4.10 样品定容液： 乙腈-0.1 %甲酸溶液(75+25)。量取 75 mL 乙腈(4.3)与 25 mL 的 0.1 %甲酸溶液(4.9)， 混匀。 4.11 玉米赤霉烯酮标准储备液：100.0 mg/L。准确称取适量玉米赤霉烯酮标准物质（4.6）用甲醇溶解 并全部转移至 50 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀，0 ℃~4 ℃可避光保存 6 个月。 1 DB22/T 1618—2012 4.12 玉米赤霉烯酮标准工作液：准确吸取玉米赤霉烯酮标准储备液（4.11）1.0 mL 于 100 mL 容量瓶 中用甲醇稀释成 1.0 mg/L 的溶液，准确吸取上述标准溶液适量于容量瓶中，用甲醇依次配制成浓度为 2.0 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L、50.0 μg/L、100.0 μg/L、200.0 μg/L、500.0 μg/L 的系列标准溶液。 4.13 玉米赤霉烯酮免疫亲和柱：60 mg/3 mL。 4.14 纤维滤纸：直径 11 cm，孔径 1.5 μm，无荧光特性。 4.15 滤膜：0.22 µm，有机系。 5 仪器与设备 5.1 液相色谱-串联质谱仪：配备电喷雾离子源（ESI）。 5.2 高速匀浆机。 5.3 高速离心机：10 000 r/min。 5.4 超声波清洗器：40 kHz。 5.5 天平：感量 0.0001 g 和 0.01 g。 5.6 具塞聚丙烯或聚四氟乙烯离心管：50 mL。 5.7 涡旋混合器。 5.8 氮吹仪。 5.9 0.28 mm 孔筛。 6 试样制备与保存 取有代表性样品，粉碎，过 0.28 mm 筛，混匀备用。 7 分析步骤 7.1 提取 称取4 g试样（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入0.6 g氯化钠，20 mL乙腈-水溶液(4.8)， 涡旋 混合1 min，10 000 r/min均质1 min，超声15 min后，10 000 r/min冷冻离心4 min，取4 mL上清液于另一 离心管中，加入16 mL水进行稀释，加入200 μL乙酸铅溶液（4.7），涡旋混匀后10 000 r/min冷冻离心4 min，过纤维滤纸，滤液待净化。 7.2 净化 将注射器连接于免疫亲和柱（4.13）上方，准确加入上述滤液 10 mL，使滤液以不超过 1 滴/秒的速 度通过免疫亲和柱，直至有部分空气通过柱体。用 5 mL 水淋洗柱子，并使部分空气通过柱体，用 1.5 mL 以不超过 1 滴/秒的流速洗脱至玻璃试管中，55 ℃氮气吹干，用样品定容液（4.10）定容至 1 mL，过 0.22 μm 滤膜，待测。 2 DB22/T 1618—2012 7.3 空白试验 除不称取试样外，均按 7.1、7.2 进行。 7.4 测定 7.4.1 色谱参考条件 色谱参考条件如下： a） 色谱柱：C18，2.1mm×150 mm，3.5 μm； b） 柱温：室温； c） 流速：0.20 mL/min； d） 进样量：10 μL； e） 流动相：乙腈-0.1 %甲酸溶液（75+25)。 7.4.2 质谱参考条件 质谱参考条件如下： a) b) c) d) e) 电离方式：电喷雾电离（ESI）； 扫描方式：负离子扫描； 检测方式：多反应监测（MRM）； 电离电压：-3 kV~-5 kV； 脱溶剂气：0.75 MPa； f) g) h) i) j) 雾化气：0.625 MPa； 辅助气：0.625MPa； 碰撞气：0.15 MPa； 离子源温度：300 ℃~550.0 ℃； 定性离子对、定量离子对、去簇电压、碰撞能量见表 1。 表1 化合物名称 玉米赤霉烯酮的监测离子对、去簇电压和碰撞能量 母离子 玉米赤霉烯酮 m/z 317 子离子 m/z 去簇电压 碰撞能量 V V 175* -100 -31 273 -93 -28 299 -102 -27 注：带“*”的为定量离子。 7.4.3 定性分析 在同一色谱/质谱条件下进行标准溶液和样品溶液的测定，如果样品溶液中检出的色谱峰的保留时 间与标准物质色谱峰的保留时间一致，所选择的两对子离子的质荷比也一致，而且样品定性离子的相对 丰度与浓度相当标准工作溶液的定性离子的相对丰度相比较，相对标准偏差不超过表2规定的范围，则 可判定样品中存在该物质。标准溶液的多反应监测色谱图参见附录A。 3 DB22/T 1618—2012 表2 定性确定时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 ＞50% ＞20%至50% ＞10%至20% ≤10% 允许的相对偏差 ±20% ±25% ±30% ±50% 7.4.4 定量测定 根据试样中被测样液中被测组分的含量情况，选取响应值相近的标准工作液进行分析，对于高浓度 样品须适当进行系列稀释。标准工作液和样液中被测组分的响应值均应在仪器线性响应范围内。在上述 色谱条件下，玉米赤霉烯酮的参考保留时间为3.00 min，外标法定量。标准溶液的多反应监测色谱图参 见附录A。 8 结果计算和表述 按（1）式计算试样中玉米赤霉烯酮含量，计算结果需扣除空白值。 X = c ´V m ..........................................................................................(1) 式中： X —— 试样中玉米赤霉烯酮残留量，单位为微克每千克 (μg/kg)； c —— 从标准曲线读出的玉米赤霉烯酮溶液浓度，单位为微克每升(μg/L)； V —— 样液最终定容体积，单位为毫升 (mL)； m ——样液所代表的最终试样的质量，单位为克 (g)。 计算结果表示到小数点后一位。 9 定量限、回收率和精密度 9.1 定量限 本标准方法玉米赤霉烯酮的定量限为5.0 μg/kg。 9.2 回收率及精密度 在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于这两个测定结果的算术平均值的15 %。 试样中玉米赤霉烯酮的添加浓度及其回收率、精密度实验数据参见附录B。 4 DB22/T 1618—2012 AA 附 录 A （资料性附录） 标准溶液多反应监测（MRM）色谱图 图A.1 玉米赤霉烯酮标准溶液多反应监测（MRM）色谱图 (10.0 mg/L) 5 DB22/T 1618—2012 BB 附 录 B （资料性附录） 不同添加水平平均回收率及精密度（n=10） 表B.1 不同添加水平平均回收率及精密度（n=10） 样品名称 玉米蛋白饲 料 纤维饲料 玉米麸质饲 料 添加浓度 回收率范围 相对标准偏差 mg /kg % % 5.0 95.6～105.0 2.95 10.0 93.1～103.1 3.19 50.0 96.8～103.8 2.23 5.0 85.6～99.6 4.06 10.0 79.0～99.6 2.90 50.0 84.8～90.6 1.68 5.0 97.6～104.8 2.38 10.0 89.2～102.2 3.83 50.0 92.6～98.8 1.87 ________________________________ 6