ICS 67.050 B 04 备案号：35747-2013 吉 林 DB22 省 地 方 标 准 DB 22/T 1619—2011 牛尿中盐酸克伦特罗残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法 Determination of Clenbuterol residue in the cow urine—— HPLC-MS/MS method 2012 - 12 - 01 发布 吉林省质量技术监督局 2013 - 01 - 01 实施 发 布 DB22/T 1619—2012 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。 本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口。 本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心。 本标准主要起草人：马书民、张勋、赵庆松、杨璐、胡婷婷、康明芹、王明泰、荣会。 I DB22/T 1619—2012 牛尿中盐酸克伦特罗残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法 1 范围 本标准规定了牛尿中盐酸克伦特罗残留量的液相色谱-质谱/质谱测定方法。 本标准适用于牛尿中盐酸克伦特罗残留量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 3 原理 本方法采用高氯酸溶液沉淀蛋白，氢氧化钠溶液调节pH值后，用乙酸乙酯萃取，样液经浓缩后过 混合型阳离子交换固相萃取柱净化，液相色谱-质谱/质谱仪测定，外标法定量。 4 试剂与材料 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 4.10 4.11 4.12 4.13 4.14 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。 盐酸克伦特罗标准物质（CAS：37148-27-9）：纯度≥98.5％。 乙腈：色谱纯。 乙酸乙酯：色谱纯。 甲醇：色谱纯。 甲酸：色谱纯。 高氯酸：含量为 70%～72%。 氨水: 含量为 25%～28%。 氢氧化钠。 0.1 mol/L 高氯酸溶液：0.83 mL 高氯酸溶解于 100 mL 水中，混匀备用。 1 mol/L 氢氧化钠溶液：称取 4g NaOH，溶于 100mL 水中，混匀备用。 0.1%甲酸溶液：准确吸取 1 mL 甲酸（4.5），用水定容至 1 L，混匀后备用。 50%甲醇溶液（50+50）：50 mL 甲醇（4.4）与 50 mL 水混匀。 5%氨化甲醇（95+5）：95 mL 甲醇（4.4）与 5 mL 氨水（4.7）混匀。 标准储备溶液：准确称取适量的标准品， 用甲醇(4.4)配制成 100.0 mg/ L 的标准贮备液，在 0 ℃～ 4 ℃冰箱中保存。 4.15 标准工作溶液：根据需要用甲醇 (4.4)稀释配制适当浓度的标准工作液，现用现配。 4.16 有机相微孔滤膜：0.22 µm。 1 DB22/T 1619—2012 4.17 混合型阳离子交换固相萃取柱（MCX 固相萃取柱）：60 mg/3 mL。使用前依次用 3 mL 甲醇、3 mL 水活化。 5 仪器与设备 5.1 液相色谱-质谱/质谱仪：配备电喷雾离子源（ESI）。 5.2 氮吹仪。 5.3 旋转蒸发器。 5.4 天平：感量 0.0001 g 和 0.01 g。 5.5 涡旋混合器。 5.6 离心机：转速大于 7000 r/min。 6 分析步骤 6.1 提取 取5 mL样品（精确到0.1 mL）于50 mL离心管中，加入5 mL高氯酸溶液（4.9）于涡旋混合器上 充分混合，用1 mol/L NaOH溶液调节溶液的pH值至9.5±0.1，加入20 mL乙酸乙酯，涡旋振荡混匀。4 ℃ 条件下10000 r/min离心5 min，重复提取三次，合并乙酸乙酯相，放入浓缩瓶中，35℃旋至近干，用5 mL 0.1%甲酸溶液(4.11)定容，待净化。 6.2 净化 将上述样液过MCX柱净化，依次用5 mL甲醇（4.4）、5 mL水和5 mL 0.1%甲酸水溶液(4.11)对柱子 进行预处理，将样品溶解液以1.0 mL/min的流速加载在MCX（4.17）小柱上，再依次用5 mL 0.1%甲酸溶 液、5 mL水、5 mL50%甲醇(4.12)洗柱，弃去淋洗液；真空抽干MCX柱2 min，用5 mL5%氨化甲醇（4.13） 进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液在45℃下氮气流吹干，加入1 mL乙腈：0.1%甲酸溶液（30:70）溶解残 渣，过0.22 µm滤膜，进行HPLC-MS/MS测定分析。 6.3 空白试验 除不称取试样外，均按6.1和6.2进行。 6.4 测定 6.4.1 色谱参考条件 色谱参考条件如下： a) 色谱柱：C18 柱，150 mm×2.1 mm (i.d)，3.5 μm 或相当者； b) 流动相：乙腈- 0.1%甲酸水（30+70）； c) 流速：0.20 mL/min； d) 柱温：30 ℃； e) 进样量：10 μL。 6.4.2 质谱参考条件 质谱参考条件如下： a) 离子源：电喷雾离子源（ESI）； 2 DB22/T 1619—2012 b) c) d) e) f) g) h) 扫描方式：正离子扫描，检测方式：多反应监测（MRM）； 电离电压：3 kV～5 kV； 离子源温度：300 ℃～550 ℃； 脱溶剂气：0.21 MPa； 雾化气：0.31 MPa； 辅助气：0.31 MPa； 定性离子对、定量离子对、去簇电压、碰撞能量见表 1。 表1 盐酸克伦特罗选择监测离子(m/z)、碰撞气能量及去簇电压参数 名称 定量离子对 定性离子对 碰撞气能量 （eV） 去簇电压 (V) 盐酸克伦特罗 277.0﹥203.0 411.2﹥203.0 411.2﹥259.0 25 25 50 6.4.3 定性分析 在同一色谱/质谱条件下进行标准溶液和样品溶液的测定，如果样品溶液中检出的色谱峰的保留时 间与标准物质色谱峰的保留时间一致，所选择的两对子离子的质荷比也一致，而且样品定性离子的相对 丰度与浓度相当标准工作溶液的定性离子的相对丰度相比较，相对标准偏差不超过表2规定的范围，则 可判定样品中存在该物质。标准物质多反应监测色谱图参见附录A。 表2 定性确定时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 ＞50% ＞20%至50% ＞10%至20% ≤10% 允许的相对偏差 ±20% ±25% ±30% ±50% 6.4.4 定量测定 根据试样中被测样液中被测组分的含量情况，选取响应值相近的标准工作液进行分析，对于高浓度 样品须适当进行系列稀释。标准工作液和样液中被测组分的响应值均应在仪器线性响应范围内。在上述 色谱条件下，盐酸克伦特罗的参考保留时间为4.71 min。 7 结果计算和表述 按式（1）计算试样中盐酸克伦特罗残留量： X = c´v ........................................(1) V 式中： X── 试样中被测物含量，单位为微克每升，μg /L； c──从标准曲线读出的被测物浓度，单位为微克每毫升，ng/mL； v── 样液最终定容体积，单位为毫升，mL； V ──样液所代表的最终试样的体积，单位为毫升，mL。 计算结果表示到小数点后两位。 8 定量限、回收率和精密度 3 DB22/T 1619—2012 8.1 定量限 本方法的定量限为0. 10 μg/L。 8.2 回收率及精密度 在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于这两个测定结果的算术平均值的15 %。 样品中盐酸克伦特罗的添加浓度及其回收率、精密度实验数据参见附录B。 4 DB22/T 1619—2012 附 录 A （资料性附录） 盐酸克伦特罗的多反应监测色谱图 图A.1 盐酸克伦特罗标准品的多反应监测色谱图（0.10 ug/L） A 5 DB22/T 1619—2012 BB 附 录 B （资料性附录） 不同添加水平平均回收率及精密度（n=10） 表B.1 盐酸克伦特罗的添加回收率和精密度 样品 牛尿 添加浓度范围（0.10～1.0 ug/L ） 回收率范围（%） 相对标准偏差（%） 84.0～101.6 2.4～2.6 ______________________ 6