ICS 65.100.10 B 65 备案号：37440-2013 吉 林 DB22 省 地 方 标 准 DB 22/T 1782—2013 布氏白僵菌粉剂生产技术规程 Technical regulations for powder production of Beauveria brongniatii 2013 - 04 - 01 发布 吉林省质量技术监督局 2013 - 06 - 01 实施 发 布 DB22/T 1782—2013 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由吉林省林业厅提出并归口。 本标准起草单位：吉林市林业科学研究院。 本标准主要起草人：张海军、陈玉宝、王有菊、王江、李茂军。 I DB22/T 1782—2013 布氏白僵菌粉剂生产技术规程 1 范围 本标准规定了布氏白僵菌一级菌种生产，二级菌种生产，菌剂生产，菌剂干燥、粉碎、包装、储藏， 及质量检验等技术内容。 本标准适用于布氏白僵菌粉剂生产。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 25864-2010 球孢白僵菌粉剂 NY/T 883-2004 农用微生物菌剂生产技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 布氏白僵菌 beauveria brongniatii (Sacc.)Petch 又名卵孢白僵菌，一种半知菌类的虫生真菌，分类上属于真菌门（Eumycota），半知菌亚门 （Deuteromycotina），丝孢纲（Hyphomycetes），丛梗孢目（Moniliaceae），丛梗孢科（Moniliaceae）、 白僵菌属（ Beauveria）。 3.2 原种 stock culture 习惯上称“母种”，由固体培养基培养保藏的原始纯化菌种。 4 一级菌种生产 4.1 培养基 马铃薯200 g切块（1 cm×1 cm×1 cm）煮沸30 min，过滤，取滤液，定容至1000 ml，加入琼脂20 g， 全部溶解后加蔗糖或葡萄糖20 g、牛肉膏1 g、蛋白胨1 g，煮至完全融化；用盐酸或氢氧化钠调解pH 至5。 4.2 分装 按每试管10 ml定量分装至20 mm×200 mm试管中；用纯棉棉塞封盖试管口，松紧适度。 1 DB22/T 1782—2013 4.3 灭菌 试管直立于高压灭菌锅中，灭菌温度121 ℃～126 ℃，压力0.1 Mpa～0.15 Mpa，时间30 min。 4.4 摆制斜面 灭菌后，在无菌室的桌面上立即摆放斜面，原则是在培养基不湿棉塞的情况下，尽量延长培养基的 斜面长度；斜面培养基凝固后即可接种。 4.5 接种 在无菌条件下，取下原种试管和一级斜面培养基试管棉塞，酒精灯火焰烧灼试管管口3 s～5 s，用 2 2 无菌接种针挑取原种25 mm ～50 mm ，接种于一级斜面培养基上，用接种针轻轻来回拉动2 次～3 次， 在酒精灯火焰前，用原棉塞封盖试验管口。 4.6 一级菌种培养、保存 在25 ℃恒温培养箱中培养10 d～12 d ，观察剔除污染试管；保存在4 ℃～5 ℃冰箱中备用。 4.7 菌种复壮 4.7.1 复壮条件 复壮条件应参照NY/T 883-2004中4.1.5条执行。 4.7.2 复壮方法 在暗室，30 W紫外灯，距菌种表面30 cm，照射30 min，保持黑暗24 h，重新接种。 5 二级菌种生产 5.1 培养料配制 按麦麸、稻糠和谷糠5：3：2的比例混合，用0.1%KmnO4水溶液按与培养料质量比1：1的比例搅拌均 匀。 5.2 分装 将培养料装入600 ml普通培养瓶，装瓶至容积的2/3，用耐高温聚丙烯塑料薄膜封口。 5.3 灭菌 灭菌温度121 ℃～126 ℃，压力0.1 Mpa～0.15 Mpa，时间30 min。 5.4 接种 灭菌12 h后，在超净工作台上，用无菌接种针，按每支一级菌种试管接7 瓶～9 瓶的数量，将一级 菌种迅速移至二级瓶中，并封盖。 5.5 振荡 接种后振荡，使培养料均匀散开并使菌种均匀分布于培养料内。 5.6 培养条件 2 DB22/T 1782—2013 在无阳光直射，23 ℃～25 ℃的条件下培养8 d～10 d。 6 菌剂生产 6.1 消毒 3 培养室按5 g/m 高锰酸钾加10 ml福尔马林的用量，进行熏蒸消毒12 h；培养盘及塑料薄膜浸入0.1% 高锰酸钾水溶液中消毒1 h，擦拭干净备用。 6.2 培养料配制 同5.1。 6.3 培养料装袋 装于规格为30 cm×20 cm耐高温聚丙烯菌袋中，每袋装培养料400 g～500 g，折叠袋口。 6.4 灭菌 将培养料袋分层置于高压灭菌锅中，灭菌温度121 ℃～126 ℃，压力0.1 Mpa～0.15 Mpa，时间35 min。 6.5 接种 灭菌12 h后，在无菌条件下，按每瓶二级菌接种1 kg培养料充分混合进行扩繁。 6.6 装盘、培养 培养盘下铺塑料薄膜，将培养料装入培养盘中，装至平盘，上盖塑料薄膜。 置于无阳光直射23 ℃～25 ℃培养室的培养架上培养5 d～6 d。 7 菌剂干燥、粉碎、包装和储藏 7.1 干燥、粉碎 在无阳光直射、通风的室内阴干或用恒温干燥箱30 ℃快速烘干；干燥的标准为含水率≤10 %。 采用40 目筛片的电动粉碎机粉碎。 7.2 包装、储藏 采用密封塑料袋封装，以每袋盛装菌剂5 kg为宜，外套编织袋；在干燥、避光条件下储藏，8 ℃以 下储藏期不超过6 个月。 8 质量检验 8.1 抽样 抽样方法应参照GB/T 25864-2010中5.1条执行。 8.2 含水率测定 含水率测定方法应参照GB/T 25864-2010中5.5条执行。 3 DB22/T 1782—2013 含水率标准为≤10%。 8.3 含孢量测定 含孢量测定方法应参照GB/T 25864-2010中5.3条执行。 含孢量≥100 亿/g。 8.4 活孢率测定 准确称取蛋白胨0.5 g、 蔗糖0.5 g、 磷酸氢二钾0.1 g，倒入250 mL锥形瓶中，用蒸馏水定容至 100 mL，放入待测菌粉0.2 g，振荡2 min，将混合菌液滴在清洁的载玻片上，将载玻片放入垫有湿滤纸 的培养皿中，置于25 ℃恒温箱中培养16 h～20 h，盖上盖玻片，600倍显微镜镜检；芽管大于孢子半径 的孢子为萌发孢子；查数10个视野萌发芽孢子数和检查孢子总数；按（1）公式计算孢子萌发率： R= N ´ 100% ..................................... (1) M 式中： R—孢子萌发率,%； N—萌发孢子总数； M—检查孢子总数。 每个样品设3个重复，取3个重复均值作为该批次菌粉的活孢率。 储藏期6个月时，活孢率≥80%。 4 DB22/T 1782—2013 AA 附 录 A （资料性附录） 布氏白僵菌形态特征图表 中名 布 氏 白 僵 菌 学名 菌落特征 菌丝特征 孢子特征 色素特征 Beauveria brongniatii (Sacc．)Petch 表面乳白色至 淡黄色，菌落茸 毛状或棉絮状， 培养的后期变 为粉状。 无色、透明、 有横隔膜， 直 径 为 1.5 μm—2.0μ m。 分生孢子椭圆形至亚圆 形 ，直 径 2.0μ m — 6.0 μ m × 1.5 μ m— 3.0 μ m，生于产孢细胞顶端所 延伸的“Z”字形丝状器 使明胶培养基底 部呈深红色至紫 色；有的菌丝能 使 PDA 培养基 呈 浅紫色。 上。 图A.1 布氏白僵菌形态特征图表 _________________________________ 5