ICS 65.120 B 46 备案号：35987-2013 吉 林 DB22 省 地 方 标 准 DB 22/T 1696—2012 饲料中阿福特罗的测定 液相色谱-质谱/质 谱法 Determination of Arformoterol in feeds——LC-MS/MS method 2012 - 12 - 21 发布 吉林省质量技术监督局 2013 - 01 - 01 实施 发 布 DB22/T 1696—2012 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。 本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。 本标准起草单位：吉林省产品质量监督检验院、吉林大学。 本标准主要起草人：李媛媛、刘斌、关树文、张爽、刘静秋、李滢倩、王颖、王庆峰、刘桂华、石 金娥、李宁、毛燕、郎乐、包懿、李丹。 I DB22/T 1696—2012 饲料中阿福特罗的测定 液相色谱-质谱/质谱法 1 范围 本标准规定了饲料中阿福特罗的液相色谱-质谱/质谱测定方法。 本标准适用于饲料中阿福特罗的测定。 本标准方法检测限为10 μg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料 采样 3 原理 试样用盐酸-甲醇混合溶液溶解提取、醋酸铅沉淀蛋白后用固相萃取小柱净化，洗脱液经氮气吹干 后用甲酸胺溶液溶解，供液相色谱-质谱质谱检测，外标法定量。 4 4.1 4.2 4.3 4.4 试剂与材料 所有试剂，如未注明规格，均指分析纯；除另有说明外，水为GB/T 6682规定的一级水。 盐酸（36%）。 氨水（25%）。 醋酸铅。 甲酸胺。 4.5 甲醇。 4.6 甲酸:色谱纯。 4.7 阿福特罗（C23H30N2O10, CAS 号:73573-87-2）：纯度≥98 %。 4.8 盐酸溶液[c(HCl)=0.1mol/L]：吸取 8.3 mL 盐酸(4.1)置于 1000 mL 容量瓶中，用水稀释后，定容 至刻度。 4.9 盐酸甲醇溶液：取 80 mL 盐酸溶液(4.8)，加入 20 mL 甲醇(4.5)混匀。 4.10 饱和醋酸铅溶液：在 50 mL 水中加入一定量的醋酸铅(4.3)，超声 5 min，直至固体不再溶解。 4.11 甲酸水溶液(0.2%)：取 1 mL 甲酸(4.6)，加水定容至 500 mL。 4.12 氨甲醇水溶液(5%)：取 5 mL 氨水(4.2)与 95 mL 甲醇(4.5)混合。 4.13 甲酸铵溶液(c=10 mmol/L)：称取 0.063 g 甲酸铵至 100 mL 容量瓶，加水定容。 4.14 阿福特罗标准贮备液(1 mg/mL)：称取 0.1 g（精确至 0.1 mg）阿福特罗(4.7)，至 100 mL 容量 瓶，甲醇(4.5)定容。2 ℃～8 ℃冷藏保存。 保质期一周。 1 DB22/T 1696—2012 4.15 阿福特罗标准工作液(1 μg/mL)：吸取 0.1 mL 阿福特罗标准贮备液(4.14)，用甲酸水溶液(4.11) 定容至 100 mL。2 ℃～8 ℃冷藏保存。保质期一周。 4.16 固相萃取小柱：混合型阳离子交换柱（60 mg,3 mL）。 4.17 滤膜: 0.22µm。 5 仪器 5.1 液相色谱-质谱联用仪：配有电喷雾电离源。 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 6 氮气吹干仪。 离心机，转速大于 7000 r/min。 分析天平：感量 0.1 mg。 粉碎机。 旋涡振荡器。 固相萃取装置。 试样制备 按照GB/T 14699.1采样，将实验样品粉碎，充分混合均匀后待用。 7 分析步骤 7.1 提取 称取试样2 g(精确至0.01 g)于50 mL离心管中，准确加入19 mL盐酸甲醇溶液(4.9)和1 mL饱和醋酸 铅溶液(4.10)，充分振荡20 min，然后于7000 r/min离心10 min，上清液备用。 7.2 净化 固相萃取小柱先用3 mL甲醇、3 mL水活化。取上清液5 mL过柱，用2 mL水和2 mL甲醇淋洗，空气抽 干2 min，用5 mL氨甲醇水溶液(4.12)洗脱，收集洗脱液，氮吹干，用1 mL甲酸胺溶液(4.13)溶解，过 滤膜，待测。 8 液相色谱-串联质谱测定 8.1 色谱参考条件 色谱参考条件如下： a) 色谱柱：C8 柱(50 mm ×2.1 mm (i.d )，3 µm)，或其他等效柱； b) 流动相：A 为 10mmol/L 甲酸胺溶液（pH 4），B 为甲醇，梯度洗脱程序见表 1； c) 柱温：40 ℃； d) 流速：0.5 mL/min； e) 进样体积：5.0 µL。 表 1 梯度洗脱程序 2 DB22/T 1696—2012 时间 min A % B % 0 65 35 1.5 80 20 2 80 20 2.5 30 70 3 30 70 3.5 65 35 8.2 质谱参考条件 质谱参考条件如下： a) 电离方式：电喷雾电离，正离子； b) 电喷雾电压：4 kV； c) 扫描模式：多反应监测（MRM），母离子 m/z 345.2，定量离子 m/z 149.1，定性离子 m/z 327.5； d) 裂解电压：115 V。 8.3 定性测定 按照上述条件测定试样和标准工作溶液，如果试样中的质量色谱峰保留时间与标准工作溶液一致 （变化范围在±2.5%之内）；试样中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰 度一致，相对丰度偏差不超过表2的规定，则可以判断试样中存在阿福特罗。 表 2 定性离子相对丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 ＞50% 允许的相对偏差 ±20% ＞20%至50% ±25% ＞10%至20% ±30% ≤10% ±50% 8.4 定量测定 本方法采用外标法单离子定量测定，定量离子m/z 345.2/149.1，待测样液中阿福特罗的相应值应 在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。在上述色谱条件下，阿福特罗标准物质 的多反应监测（MRM）色谱图参见附录A中图A.1。 8.5 平行试验 按上述步骤，对同一样品进行平行试验测定。 9 结果计算 测定结果可由计算机自动计算阿福特罗的含量，也可按式（1）计算： X= C ´V ´ n .....................................(1) m 式中： 3 DB22/T 1696—2012 Ｘ—试样中阿福特罗的含量，单位为微克每千克（μg /kg）； c—由标准曲线查得试液中阿福特罗的浓度，单位为微克每升（μg /L）； V—试样定容体积，单位为毫升（mL）； n—稀释倍数； m—试样取样质量，单位为克（g）。 10 精密度 在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过算术平均值10%。 在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过算术平均值10%。 4 DB22/T 1696—2012 A A 附 录 A （资料性附录） 阿福特罗参考谱图 阿福特罗标准溶液参见色谱图A.1。 图A.1 阿福特罗标准溶液 LC-MS/MS 多反应监测质量色谱图(50 μg/kg) _________________________________ 5