ICS 59.140.20 B 45 吉 DB22 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2079—2014 皮革中动物源性成分检测 实时荧光 PCR 法 Detection of animal-derived ingredients in leather by real time PCR method 2014 - 05 - 04 发布 吉林省质量技术监督局 2014 - 06 - 01 实施 发 布 DB22/T 2079—2014 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国吉林出入境检验检疫局提出并归口。 本标准起草单位： 中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、中华人民共和国延边出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：刘金华，聂丹丹，刘韬，王玮琳，刘阳，吴连鹏，王宁，罗雁菲。 I DB22/T 2079—2014 皮革中动物源性成分检测 实时荧光 PCR 法 1 范围 本标准规定了天然皮革中动物源性成分的定性检测方法。 本标准适用于天然皮革牛、羊、猪成分的定性PCR检测，不适用于再生革、人造革和合成革。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 利用实时荧光PCR技术，根据不同物种的特异性基因序列对牛、羊、猪源性成分进行鉴定。利用CTAB 裂解液破碎细胞，酚、三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA；以提取的DNA为模板进行实时荧光PCR 检测；通过特异性引物和标记荧光物质探针进行牛、羊、猪源性成分的实时荧光PCR扩增，根据PCR扩增 反应中每一个循环产物荧光信号的扩增曲线判定，实现对皮革中牛、羊、猪源性成分的定性分析。 4 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水符合 GB／T6682 中二级水的要求。 4.1 4.2 4.3 4.4 十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethyl ammonium bromide,CTAB)。 三羟甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane,Tris]。 三氯甲烷(chloroform)。 无水乙醇(absolute ethanol)。 4.5 异丙醇(isopropyl alcohol)。 4.6 75%乙醇溶液：取 750 mL 无水乙醇，加水定容至 1 L。 4.7 乙二胺四乙酸钠盐（Na2EDTA）。 4.8 苯酚/三氯甲烷/异戊醇(25:24:1,体积比）。 4.9 2X Real-time PCR 预混液。 4.10 Tris-HCl：在 800 mL 去离子水中溶解 121.1g 三羟甲基氨基甲烷(Tris)，加入 60 mL 浓盐酸， 冷却至室温后调节 pH 值至 7.5，加水定容至 1 L，分装后 121℃高压灭菌 20min。 4.11 1.2 mol/L 氯化钠溶液 4.12 CTAB 裂解液：2％CTAB ，1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0)， 0.02 mmol/L Na2-EDTA (pH 8.0)。 4.13 TE 缓冲液：配制每升 TE 缓冲液，应在 800 mL 水中依次加入 1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)10 mL,O.5mol/L EDTA(pH8.0) 2 mL，加水定容至 1L，分装后 121℃高压灭菌 20min。 1 DB22/T 2079—2014 4.14 4.15 4.16 CTAB 沉淀液：0.5％ CTAB， 0.04 mmol/L NaCl。 蛋白酶 k 溶液（20 mg/mL） 引物及探针序列：天然皮革中牛、羊、猪 PCR 检测引物信息见表 1。 表1 检测基因 牛、羊、猪 PCR 检测引物信息 引物序列 哺乳动物特 上游引物：5’-AGTGCTTAGTTGAATTAGGCCATG-3’ 异基因 下游引物：5’-TCCAGTATGCTTACCTTGTTACGA-3’ 基因性质 适用范围 12S rRNA基因 皮革及其加 工品 探针：5’-（FAM）-CGCACACACCGCCCGTCACCC-（TAMRA）-3’ 牛内源基因 上游引物：5’- CCGATGGATGTGTTCAGAGCT-3’ 牛生长素基因 牛皮及其加 下游引物：5’- GCCAAATGTCTGGGTGTAGATACC-3’ 工品 探针：5’-（FAM)-TGGGCTTTAGGGCTTCCGAATGTGAA-(TAMRA) -3’ 羊内源基因 上游引物：5'-ACACAACTTCTACCACAACCC-3' 羊线粒体 羊皮及其加 下游引物：5'-AAACAATGAGGGTAACGAGGG-3' ATPase 亚基 工品 上游引物：5'- CATGCGTATCACCACCATTATATC-3’ 猪线粒体 猪皮及其加 下游引物：5'- TGCCAAGCGGGTTGCT-3' D-LOOP基因 工品 探针：：5'- (FAM) –ACACCGAAACAAAATACTCCTTGAGAAACA-(TAMRA) -3’ 猪内源基因 探针：5'-（FAM）- CGAGCTTAACTACCATGCCGCGTGA -(TAMRA) -3’ 5 仪器与设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 μL。 实时荧光 PCR 检测系统。 高速冷冻离心机(12 000 r/min)。 涡旋混合器。 分析天平：感量 0.01 g。 微量移液器：0.1μL ~2.5 μL，1μL ~10 μL，2μL ~20 μL，10μL ~100 μL，20μL ~200 μL，100μL ~1000 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 恒温水浴箱。 湿热高压蒸汽灭菌器。 解剖刀。 剪刀。 6 试样处理 3 用消毒的解剖刀去除皮张表面的毛发及其它附着物，用消毒的剪刀将皮张剪成1 mm 大小的颗粒。 7 检验步骤 7.1 样品 DNA 的提取 2 DB22/T 2079—2014 7.1.1 称取约 100 mg 该颗粒置于 2 mL 离心管中,以去离子水振荡洗涤三次，10 000 r/min 离心 5 min， 倾去上层清液。 7.1.2 加入 1.0 mL CTAB 裂解液及 50 µL 蛋白酶 K 溶液，涡旋震荡 30 s 后，颠倒混合 5 次，65 ℃ 水浴过夜（12h-16h）。 7.1.3 室温 12 000 r/min 离心 10 min，取上层溶液 800 µL， 加入等体积的 Tris 饱和酚/三氯甲烷/ 异戊醇（25:24:1，v/v/v），轻轻颠倒离心管混匀，室温 12 000 r/min 离心 10 min ；取上层清液(水 相)于一新离心管中，加入等体积的三氯甲烷/异戊醇（24:1，v/v），颠倒混匀，室温 12 000 r/min 离心 10 min，取上清液 600 µL，加入 2 倍体积的 CTAB 沉淀液，混匀，室温静置 60 min。12 000 r/min 离心 15 min，弃上清液。加入 500 µL 氯化钠溶液溶解沉淀，然后加入 500 µL 三氯甲烷，振荡混匀， 12 000 r/min 离心 10 min，将上清液移至一新离心管，加入 0.6 倍体积的异丙醇，混匀，4 ℃静置 30 min ，4 ℃，12 000 r/min 离心 10 min，小心弃去上清液，向沉淀加入 500 µL 70% 冷乙醇，洗涤沉 淀，4 ℃，12 000 r/min 离心 5 min，小心倒出上清液，室温干燥后，将 DNA 溶于 50 µL 去离子水中， -20 ℃保存。也可使用等效的商品化试剂盒提取模板 DNA。 7.2 DNA 浓度和纯度的测定 取 5 µL DNA 溶液加二次蒸馏水稀释至 1 mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 260 nm 和 280 nm 处的吸光值 A260 和 A280。DNA 的浓度按式（1）计算： c= A ´ N ´ 50 ......................................(1) 1000 式中： c—— DNA浓度，单位为微克每微升（µg/µL）； A—— 260 nm 处的吸光值； N—— 核酸稀释倍数。 注： 当A260 / A280比值在1.7～2.0之间时，适宜于PCR扩增。 7.3 实时荧光 PCR 检测 7.3.1 扩增试剂准备 为确保检测结果的准确性，在进行样品检测时，应设立空白对照、阴性对照和阳性对照实验。 实时荧光PCR反应体系见表2 表2 实时荧光 PCR 反应体系 试剂成分 体积 2×Real-time PCR预混液 10µL 上游引物（10 µmol/L） 1µL 下游引物(10 µmol/L） 1µL 探针(10 µmol/L） 1µL 样品DNA(1～100 ng/µL) 2µL 双蒸水 5µL 注1：空白对照实验时，用双蒸水替代样品DNA。 注2：阴性对照实验时，用非目标源性成分但含有内参基因的成分替代样品DNA。 注3：阳性对照实验时，用牛、羊、猪源性成分DNA。 3 DB22/T 2079—2014 实时荧光PCR反应条件随仪器不同略有改变，一般为： 95℃/10min ，1个循环；95℃/20s ，59℃ /30s ，72℃/30s ，45个循环，在每次循环的72℃/30s时收集荧光。检测结果后，根据扩增曲线和Ct 值判定结果。 注：也可用等效的牛、羊、猪、猫、狗源性成分实时荧光PCR检测试剂盒进行实时荧光PCR检测。 8 结果判定 8.1 PCR 有效性判定 空白对照：无FAM荧光信号，相应Ct值>40。 阴性对照：无FAM荧光信号，相应Ct值>40。 阳性对照：有FAM荧光信号，且FAM通道出现明显的扩增曲线，Ct值≤36。 否则判定为PCR无效。 8.2 检测结果判定 待测样品牛/羊/猪源性基因检测Ct值大于或等于40，内参照基因检测Ct值在20～35之间者，阴性对 照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判定该样品未检出牛、羊、猪源性成分。 待测样品牛/羊/猪源性基因检测Ct值小于40，内参照基因检测Ct值在20～35之间者，阴性对照、阳 性对照和空白对照结果正常者，则可判定该样品检出牛、羊、猪源性成分。 待测样品牛/羊/猪源性基因检测