ICS 67.050 X 04 备案号：37940-2013 吉 林 DB22 省 地 方 标 准 DB 22/T 1821—2013 粮食中产单端孢霉烯族化合物真菌的 PCR 检测 Detection of trichothecenes-producing fungi in grains by PCR method 2013 - 05 - 15 发布 吉林省质量技术监督局 2013 - 09 - 01 实施 发 布 DB22/T 1821—2013 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。 本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。 本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：史艳宇、华蕾、刘金华、王莹、李媛媛、初真林、王伟、刘静秋、周亮、王潇、 刘晓晖、王颖、任明月。 I DB22/T 1821—2013 粮食中产单端孢霉烯族化合物真菌的 PCR 检测 1 范围 本标准规定了粮食中产单端孢霉烯族化合物真菌的PCR检验方法。 本标准适用于粮食中产单端孢霉烯族化合物真菌的快速筛选。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4789.15 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 WS/T 230 临床诊断中聚合酶链式反应（PCR）技术的应用 3 原理 单端孢霉烯前体（trichodiene）合成酶是催化所有真菌单端孢霉烯族化合物合成反应第一步的酶类。 根据该生化合成过程中的关键基因：单端孢霉烯前体合成酶编码基因tri5的有无来判断待检样品是否污 染了产单端孢霉烯族化合物的真菌。 4 试剂和材料 除特别说明以外，所用试剂为分析纯或生化试剂。 4.1 水：应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。 4.2 马铃薯-葡萄糖-琼脂（Potato dextrose agar，PDA）：按 GB 4789.15 规定。 4.3 CTAB 缓冲液：55 mmol/L CTAB、1 400 mmol/L 氯化钠（NaCl）、20 mmol/L EDTA、100 mmol/L Tris，用 10%盐酸（HCl）调 pH 至 8.0，121 ℃高压灭菌 20 min，储存于 2 ℃~8 ℃。 4.4 TE 缓冲液：10 mmol/L Tris、150 mmol/L 氯化钠（NaCl）、2 mmol/L EDTA、1%十二烷基磺酸钠， 用 10%盐酸（HCl）调 pH 至 8.0，121 ℃高压灭菌 20 min，储存于 2 ℃~8 ℃备用。 4.5 RNA 酶溶液（5 μg/μL）。 4.6 蛋白酶 K（20 mg/mL)。 4.7 Tris 饱和酚。 4.8 酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1）；三氯甲烷：异戊醇（24：1）。 4.9 异丙醇。 4.10 70%乙醇。 4.11 10×PCR 缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），200 mmol/L 氯化钾，15 mmol/L 氯化镁。 4.12 引物 上游：5’-GGGATGCTGGATTGAGCAG-3’ 下游：5’-CATCACCTGAGGGTCCTTGT-3’ 1 DB22/T 1821—2013 4.13 Taq DNA 聚合酶。 4.14 dNTP：dATP、dCTP、dGTP、dTTP。 4.15 分子量标记：100 bp DNA Marker。 4.16 50×TAE 电泳缓冲液：称取 484 g Tris，量取 114mL 冰醋酸，200 mL 0.5 mol/L EDTA，溶于水中， 定容至 2 L。分装后高压灭菌备用。使用前稀释成 1×TAE 电泳缓冲液（工作液）。 4.17 6×加样缓冲液：30 mmol/L EDTA、36%（体积分数）甘油、0.05%（质量浓度）二甲苯腈蓝 FF、 0.05% (质量浓度) 溴酚蓝。 4.18 琼脂糖：电泳纯。 4.19 4.20 5 阳性质控菌株：来源于正规菌种保藏机构的禾谷镰刀菌标准菌株。 阴性质控菌株：来源于正规菌种保藏机构的非目标菌株。 仪器和设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 天平：感量 0.001 g。 生物安全柜：AII 型。 霉菌培养箱：28 ℃±1 ℃。 高压灭菌器。 恒温水浴锅：65 ℃±1 ℃。 高速冷冻离心机：转速不低于 12 000 r/ min。 5.7 PCR 仪。 5.8 核酸电泳仪。 5.9 凝胶成像分析系统。 5.10 紫外分光光度计。 5.11 涡旋混合器 5.12 微量移液器：0.2 μL ~2 μL、2 μL~10 μL、20 μL~200 μL、100 μL~1 000 μL。 5.13 离心管：1.5 mL。 6 生物安全措施 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测真菌，所有培养物应小心处置。应按照 GB 19489 的规定执行。 7 废弃物处理和防止污染的措施 7.1 检验过程中的废弃物需经 121 ℃高压灭菌处理至少 30 min 后再弃置。 7.2 检验过程中防止交叉污染的措施按 WS/T 230 执行。 8 检测 8.1 样品制备与培养 参照 GB 4789.15 对样品进行稀释与培养。 8.2 DNA 提取 8.2.1 DNA 模板制备 从培养平皿上刮取菌丝 0. 2 g ~0. 5 g 于 1. 5mL 离心管，加入少许石英砂用细玻璃棒充分碾碎菌丝， 加入 500 μL CTAB、40 μL 蛋白酶 K，震荡均匀，65 ℃水浴 30 min；加入 500 μL 酚：三氯甲烷：异戊 2 DB22/T 1821—2013 醇(25：24∶1) ，强烈震荡，12 000 r/ min 离心 15 min；吸取上层水相至 1. 5 mL 离心管中，加入等体 积的异丙醇，震荡混匀，1 2000 r/ min 离心 10 min；弃上清液，用预热至 65 ℃ TE 缓冲液溶解 DNA（TE 量视 DNA 沉淀的多少而定）；加入 5 μLRNA 酶溶液，37 ℃水浴 30 min；加入 200 μL 三氯甲烷：异 戊醇(24∶1)，强烈震荡，12 000 r/ min 离心 15 min；吸取上层水相至新的 1. 5 mL 离心管中，加入等体 积的异丙醇，震荡均匀，1 2000 r/ min 离心 10 min；弃上清液，加入 1mL70 %冰乙醇洗涤沉淀 DNA， 12 000 r/ min 离心 1 min ；弃上清液，无菌条件下自然干燥，加预热至 65 ℃TE 缓冲液溶解 DNA。（如 不能及时检验，可将提取液于-20 ℃保存）。 也可使用等效的真菌基因组DNA提取试剂盒。 8.2.2 DNA 浓度测定 采用紫外分光光度法测定DNA，所测得OD值为核酸总量。紫外分光光度法检测核酸浓度的最佳范 围是2 μg/mL~50 μg/mL，值应该在0.05~1的区间内。 将DNA溶液做适当的稀释，放入紫外分光光度计的比色皿中，于 260 nm处测定其吸收值，1 OD260nm=50 μg/mL双链DNA或38 μg/mL单链DNA。PCR级DNA溶液的OD260nm / OD280nm比值为1.7~2.0。 8.3 PCR 检测 8.3.1 空白对照、阴性对照和阳性对照试验 检验过程中分别设空白对照、阴性对照、阳性对照。空白对照设为以水代替 DNA 模板；阴性对照 采用非目标菌的 DNA 作为 PCR 反应的模板；阳性对照采用禾谷镰刀菌 DNA 作为 PCR 反应的模板。 8.3.2 反应体系 表1 PCR反应体系 试 剂 加入量（μL） 10×PCR buffer 2.5 dNTP 溶液(10 mmol/L) 0.5 Taq DNA 聚合酶 (5 U/μL) 0.2 上游引物(10 μmol/L) 1.0 下游引物(10 μmol/L) 1.0 DNA 模板（100 ng/μ L) 2.0 补水至 25 8.3.3 PCR 扩增条件 94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，34个循环，72 ℃后延伸10 min， 结束反应，4 ℃保存。扩增片段长度：379 bp。 不同仪器、不同Taq DNA聚合酶可根据要求将反应条件做适当调整。 8.3.4 凝胶电泳检测 PCR 产物 用电泳缓冲液（1×TAE）制备2%琼脂糖凝胶（55 ℃~60 ℃时加入溴化乙锭至终浓度为0.5 μg/mL， 也可在电泳后进行染色）。取8 μL~15 μL PCR扩增产物，分别和2 μL上样缓冲液混合，进行点样，用DNA Ladder作参照。9 V/cm恒压电泳，电泳40 min~60 min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。 9 结果描述与判定 在阴性对照未出现条带，阳性对照出现预期379 bp的扩增条带条件下，如测试样品未出现379 bp的 扩增条带，则表示样品中无产单端孢霉烯族化合物真菌核酸；如测试样品出现379 bp扩增条带则表示样 3 DB22/T 1821—2013 品中存在产单端孢霉烯族化合物真菌核酸。 _________________________________ 4