ICS 67.120 B 45 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2600—2016 梅花鹿、马鹿茸片鉴别方法 PCR 法 Identification of Sika Deer and Wapiti Velvet Slices——Polymerase Chain Reaction Method 2016 - 12 - 22 发布 吉林省质量技术监督局 2017 - 04 - 01 实施 发 布 DB22/T 2600—2016 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2015给出的规则起草。 本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本标准起草单位：中国农业科学院特产研究所。 本标准主要起草人：杨颖、邢秀梅、荣敏、刘敏、武薇、吴琼、徐超、徐佳萍、涂剑锋、刘汇涛、 刘华淼。 I DB22/T 2600—2016 梅花鹿、马鹿茸片鉴定方法 PCR 法 1 范围 本标准规定了梅花鹿、马鹿茸片的PCR鉴定方法的原理、试剂或材料、仪器设备、试验步骤、结果 判定、废弃物处理和防止污染的措施。 本标准适用于梅花鹿、马鹿茸片产品的真伪鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 鹿茸片 deer velvet slices 为梅花鹿和马鹿的商品茸利用特制的切具切制的薄片。 4 原理 利用梅花鹿、马鹿线粒体DNA（mtDNA）的D-loop区特异性基因序列设计引物，应用聚合酶链式反应 （PCR）技术扩增特异性DNA片段，依据是否扩增出特异性片段对鹿茸片进行鉴定。 5 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 试剂或材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 水，GB/T 6882，一级。 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）。 三羟甲基氨基甲烷（Tris）。 乙二胺四乙酸二钠(EDTA)。 十二烷基硫酸钠（SDS）。 氯化钠。 三氯甲烷。 异丙醇。 无水乙醇。 1 DB22/T 2600—2016 5.10 5.11 5.12 5.13 5.14 5.15 5.16 6 70%乙醇。 CTAB 提取缓冲液：20 g/L CTAB,1.4 mol/L NaCl,0.1 mol/L Tris-HCl,0.02 mol/L Na2EDTA,pH8.0。 CTAB 沉淀液：5 g/LCTAB，40 mmol/L NaCl。 蛋白酶 K 溶液（20 mg/mL）。 NaCl 溶液（1.2 mol/L）。 TE 缓冲液（Tris-Cl、EDTA 缓冲液）：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）,1 mmol/L EDTA（pH8.0）。 引物 ， ， DF 5 -CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3 ， ， DR 5 -CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3 仪器设备 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 6.10 7 PCR 仪。 紫外分光光度计或核酸蛋白分析仪。 电泳仪。 凝胶成像系统。 电子天平：感量 0.0001 g。 离心机：离心力≥12 000 rpm。 涡旋振荡器。 恒温水浴锅。 研钵或粉碎装置。 微量移液器：0.5 μl～10 μl，10 μl～100 μl，20 μl～200 μl，200 μl～1000 μl。 试验步骤 7.1 样品制备 将样品用研钵或粉碎装置研磨成粉末状即可。 7.2 DNA 提取 7.2.1 将样品研磨后，称取 200 mg 左右样品于 2 mL 离心管中，加入 1.5 mL CTAB 提取缓冲液和 40 μL 蛋白酶 K 溶液。 7.2.2 60 ℃震荡过夜后 13000 g 离心 10 min，转移上清液到新的离心管中。 7.2.3 加入 750 μL 三氯甲烷后用力震荡，13000 g 离心 5 min，将上清液转移到新的离心管中。 7.2.4 加入 2 倍体积的 CTAB 沉淀溶液，室温静置 60 min，13000 g 离心 15 min，弃去上清液。 7.2.5 加入 350 μL NaCL 溶液将沉淀进行悬浮。再加入 350 μL 三氯甲烷，涡旋振荡进行混匀，13000 g 离心 10 min。 7.2.6 转移上清液后加入 0.6 倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室温放置 20 min，13000 g 离心 10 min， 弃去上清液。 7.2.7 加入 500 μL75%乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于 200 μL 超纯水中。立即使用或-20℃保存备用。 7.2.8 也可用等效的 DNA 提取方法提取模板 DNA。 7.3 2 DNA 质量的测定 DB22/T 2600—2016 使用紫外分光光度计或核酸蛋白分析仪，分别测定260nm和280nm处吸光值（OD）为A260和A280，DNA 浓度按公式（1）计算。当A260/A280比值在1.6～1.8之间，适宜PCR扩增。 C= A × N × 50 ..................................... (1) 1000 式中： C ——DNA浓度，为微克每微升（μg/μl）； A ——260 nm处的吸光值； N ——核酸稀释倍数。 7.4 PCR 反应体系 PCR反应体系见表1，同时设置阴性对照（超纯水）。 表1 PCR 反应体系（15μl） 反应体积 反应试剂 μl 7.5 ddH2O 9.3 10 × Buffer 1.5 dNTPs 2.0 引物 各 0.5 Taq 酶 0.2 DNA 模板 1.0 PCR 反应程序 预变性94 °C，5 min；循环扩增94 °C，30 s，56 °C/30 s，67 °C，1 min，30个循环；延伸67 °C， 5 min。 7.6 PCR 扩增产物电泳 用1×TAE电泳缓冲液配制成1%琼脂糖平板（溴化乙锭终浓度0.5% ug/ml）。将平板放入水平电泳槽 中，加入1×TAE电泳缓冲液刚刚高出凝胶表面，将PCR扩增6 ul与1 ul上样缓冲液混合，分别加入样品 孔中，取5 ul DNA Marker DL 2000加入到标准分子量对照孔内。5 V/cm恒压电泳30 min～45 min。 8 结果判定 待检样品扩增出307 bp或306 bp的特异性片段，即可判定为含有梅花鹿或马鹿鹿茸。 必要时取PCR扩增产物进行测序，结果与附录A参考序列比较，序列相似性在95%以上，可进一步确 定待测样品结果为阳性。 9 9.1 废弃物处理和防止污染的措施 检测过程中防止交叉污染按照 GB/T 27403 规定执行。 3 DB22/T 2600—2016 9.2 4 检测过程中的废弃物需经 121 ℃高压灭菌处理至少 30 min。 DB22/T 2600—2016 AA 附 录 A （资料性附录） 梅花鹿、马鹿的特征性序列 A.1 梅花鹿特异扩增片段序列（307bp） ： ACAAAGCACGTGATATAACCTTATGTGTTTGTAGTACATAAAATTAATGCATTAAGGCACA CATGTACAATGGTACATAAAATCGGTGTATAGGACATATTATGCATAATAGTACATAAATTAAT GTATTAGGACATACTATGTATAATAGTACATTATATTATATGCCCCATGCTTATAAGCATGTATT TTCTATTATCTACAGTACATAGTACATGATGTTGCTTATCGTACATAGCGCATTGAGTCAAATC AGTCCTCGTCAGCATGCGTATCCCGTCCACTAGATCACGAGCTTGATCACCATG A.2 马鹿特异扩增片段序列（306bp）： GCAAAACACGTGATATAACCTTATGCGCTTGTAGTACATAAAATCAATGTACTAGGACAT GCATGTATAACAGTACATAAGTTAGCGTATAGGACATATTATGTATAATAGTACATAAATTAATG TATCAGGACATATTATGTATAATAGTACATTATATTATATGCCCCATGCTTATAAGCATGTACTT TCTACTATCTAAAGTACATAGTACATAATGTTGTTCATCGTACATAGTACATTAAGTCAAATCA GTCCTTGTCAACATGCGTATCCCGTCCCCTAGATCACGAGCTTAATTACCATG _________________________________ 5