ICS 65.020 B 01 DB41 河 南 省 地 方 标 准 DB41/T 1379—2017 小麦品种冬春季抗寒性鉴定与评价 2017 - 04 - 24 发布 河南省质量技术监督局 2017 - 07 - 24 实施 发 布 DB41/T 1379—2017 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由河南省农业科学院提出。 本标准起草单位：河南省农业科学院小麦研究所。 本标准主要起草人：许为钢、方宇辉、齐学礼、王会伟、李艳、李春鑫、董海滨。 本标准参加起草人：张煜、张文超、赵明忠、李正玲、郭瑞。 I DB41/T 1379—2017 小麦品种冬春季抗寒性鉴定与评价 1 范围 本标准规定了冬小麦品种冬春季抗寒性鉴定的术语和定义、鉴定方法及评价。 本标准适用于小麦种质资源和品种的抗寒性鉴定与评价。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4404.1-2008 粮食作物种子 第 1 部分：禾谷类 NY/T 496-2010 肥料合理使用准则 通则 NY 525-2012 有机肥 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 冬季冻害 小麦在越冬期经历 0 ℃以下连续低温或剧烈降温天气而导致的小麦生长停滞、叶片枯死或死苗的 现象。 3.2 春季寒害 又称倒春寒，春季气温回暖后温度骤降到 0 ℃（冰点温度）以上低温对小麦造成的伤害。 3.3 隶属函数 若对论域（研究的范围）U中的任一元素x，都有一个数A(x)∈[0，1]与之对应，则称A为U上的模糊 集，A(x)称为x对A的隶属度。当x在U中变动时，A(x)就是一个函数，称为A的隶属函数。 4 抗寒性鉴定 4.1 鉴定前准备 4.1.1 种子选择 待测试小麦种质资源和品种的种子质量应符合GB 4404.1-2008的规定。 4.1.2 播种 4.1.2.1 大田 1 DB41/T 1379—2017 2 播期为当地小麦适播期。田间种植方法为随机区组排列，3 次重复，小区面积约 13.33 m ，6 行区， 2 行距 20 cm左右， 播量确保基本苗每 667 m 为 12～14 万。施肥按大田常规管理， 有机肥应符合NY 525-2012 的规定，化肥应符合NY/T 496-2010 的规定。 4.1.2.2 盆栽 选择直径30 cm，高35 cm的圆柱形盆，装肥沃表土并施足基肥，埋于试验田中，盆内土壤与盆外大 田齐平。每个参试材料种植4盆，每盆点播20穴，每穴1粒，定苗10株，施肥管理参见4.1.2.1。 4.1.3 人工气候室设置 温度变幅为±0.5 ℃，白天（8:00～20:00）采用人工光源补光，光照强度为600 μmol· m ·s 。 冬季冻害鉴定，温度为白天-10 ℃，夜间-13 ℃。春季寒害鉴定，温度为白天0 ℃，夜间-3 ℃。 -2 -1 4.1.4 取样 4.1.4.1 基本要求 当气温达到鉴定要求时，取小麦上部3片新鲜展开叶片。 4.1.4.2 冬季冻害 自然条件下，当气温降至最低温度（低于-10 ℃）后，4 h～8 h内取样。 盆栽条件下，小麦进入六叶一心时，将其移入人工气候室进行低温处理，以不进行低温处理的材料 作为对照。植株经低温处理12 h后进行取样。 4.1.4.3 春季寒害 自然条件下，气温发生比正常温度陡降8℃以上，4 h～8 h内取样。 盆栽条件下，进入拔节期后对小麦进行穗分化观察，发育至药隔期将其移入人工气候室进行低温处 理,对照设置和取样方法参见4.1.4.2。 4.1.5 仪器与试剂 测定指标所需仪器和试剂见附录A中A.1.2和A.1.3、附录 B中B.1.2和B.1.3及附录C中C.1.2和C.1.3。 4.2 鉴定方法 4.2.1 抗寒性指标测定 4.2.1.1 可溶性糖含量 采用蒽酮比色法。实验步骤和结果计算见附录A中A.2和A.3。 4.2.1.2 超氧化物歧化酶（SOD）活性 采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法。实验步骤和结果计算见附录B中B.2和B.3。 4.2.1.3 丙二醛（MDA）含量 采用硫代巴比妥酸（TBA）反应法。实验步骤和结果计算见附录C中C.2和B.3。 5 抗寒性评价 2 DB41/T 1379—2017 5.1 性状相对值计算 性状相对值计算见公式（1）。 X j = （x j /CK j ）×100% ………… （1） 式中： X j —第j个指标的性状相对值，作为评价材料抗寒性的指标； x j —低温处理下第j个指标的测定值； CK j —第j个指标的对照处理测定值。 5.2 隶属函数值计算 各参试小麦材料相对性状的隶属函数值计算见公式（2）和（3）。 ｕ（X ij ） ＝（X ij －X min ）/（X max － X min ）（与抗寒性呈正相关的指标）…………（2） ｕ（X ij ）＝1－（X ij －X min ）/（X max － X min ）（与抗寒性呈负相关的指标）…………（3） 式中： ｕ（X ij ）—第i个样品，第j个指标的隶属函数值； X ij —第i个样品，第j个指标的性状相对值； X max 和X min —某指标性状相对值的最大值和最小值。 5.3 抗寒性评价值计算 参试小麦材料的冬春季抗寒性评价值计算见公式（4）。 D i =∑ｕ（X ij ）/n 式中： D i —第i个样品的抗寒性评价值； n—测定指标数。 …………（4） 5.4 抗寒性分级 根据抗寒性评价值D将小麦的抗寒性分为三个等级，见表1。 表1 小麦抗寒性分级标准 级别 抗寒性评价值（D） 抗寒性 1 0.65<D≤1.00 强 2 0.40<D≤0.65 中等 3 0.00<D≤0.40 弱 3 DB41/T 1379—2017 AA 附 录 A （规范性附录） 小麦叶片可溶性糖含量测定 A.1 试验准备 A.1.1 材料 取被测小麦品种新鲜叶片，剪碎并混匀。 A.1.2 仪器设备 分光光度计；电子分析天平；水浴锅；100 mL容量瓶；试管；漏斗；剪刀；移液管；洗耳球等。 A.1.3 试剂及配制 蒽酮试剂：称取蒽酮200 mg溶于100 mL浓硫酸中。该试剂不能久贮，宜用前配制。 -1 100 μg·mL 蔗糖标准母液：准确称取蔗糖100 mg于烧杯加少量水溶解后，洗入100 mL容量瓶中定 容至刻度。 A.2 实验步骤 A.2.1 蔗糖标准曲线制作 取6支试管，编号，按表A.1配制每管含量为0μg～100 μg蔗糖标准液。加入表中试剂后，向各管 沿管壁迅速加入蒽酮试剂6.5 mL，并立即摇动使混合均匀，置试管架上室温下显色，冷却后倒入比色杯， 以0号管作空白对照，在620 nm波长处，以多点校准总量法，制作标准曲线。 表A.1 蔗糖标准液的配制 试剂 蔗糖标准母液/mL 蒸馏水/mL 每管蔗糖含量/μg 管号 0 1 2 3 4 5 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 2.5 2.3 2.1 1.9 1.7 1.5 0 20 40 60 80 100 A.2.2 样品提取 取低温胁迫后的新鲜小麦叶片约1 g，剪碎混匀后放入试管中，加入蒸馏水10 mL，置于沸水浴中提 取20 min，冷却后过滤入100 mL容量瓶中，以热水冲洗残渣2～3次，一并滤入容量瓶中，待冷至室温， 定容至刻度，即为样品待测液。 A.2.3 可溶性糖含量测定 4 DB41/T 1379—2017 吸取待测液0.2 mL（含糖量30μg～80 μg），加入试管中，再加蒸馏水2.3 mL，摇匀。随后沿试 管壁迅速加入蒽酮试剂6.5 mL，立刻摇动混合均匀，置于试管架上显色，冷却至室温后，以空白管作对 照，在620 nm波长处，按多点校准定量法测定待测管中提取液糖含量。 A.3 结果计算 可溶性糖含量计算见公式（A.1）。 （m×V a ）/(1000×V b ） W SS = …………（A.1） W×1000 式中： W SS —可溶性糖含量，mg·g-1； m—提取液中糖含量，μg； W—小麦叶片鲜重，g； V a —提取液总量，mL； V b —待测液用量，mL。 5 DB41/T 1379—2017 BB 附 录 B （规范性附录） 小麦叶片 SOD 活性测定 B.1 试验准备 B.1.1 材料 取被测小麦品种新鲜叶片（大田材料16:00取样），剪碎并混匀。 B.1.2 仪器设备 分光光度计；高速冷冻离心机；荧光灯（反应试管处照度为4000 Lx）、微量移液器等、离心管数 支。 B.1.3 试剂及配制 磷酸缓冲液配制：A液：0.2 M的KH 2 PO 4 溶液 称取分析纯KH 2 PO 4 27.216 g，用蒸馏水定容至1000 mL。 B液：0.2 M的K 2 HPO 4 溶液 称取分析纯K 2 HPO 4 •3H 2 O45.644 g，用蒸馏水定容至1000 mL。 0.05 M 磷酸缓冲液（pH=7.8）：A液21.25 mL+B液228.25 mL定容至1000 mL。 130 mM Met(甲硫氨酸)：取1.9399 g Met, 用磷酸缓冲液定容至100 mL；棕色瓶避光4 ℃保存。 750 μM NBT（氮蓝四唑）：取0.06133 g NBT,用磷酸缓冲液定容至100 mL；棕色瓶避光4 ℃保存。 100 μM EDTA-Na 2 ： 取0.0372 g EDTA-Na 2 用磷酸缓冲液定容至1000 mL，棕色瓶避光保存。 20 μM FD (核黄素) ： 0.00753 g FD用蒸馏水定容至1000 mL。随用随配。棕色瓶避光保存。 B.2 实验步骤 B.2.1 酶液提取 取低温胁迫后的新鲜小麦叶片约0.5 g于预冷的研钵中，加1 mL预冷的0.05 M磷酸缓冲液（pH=7.8） 在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使最终体积为5 mL，在4 ℃冷冻离心4000 r/min下离心20 min，上清液即 为SOD酶粗提液，置于0 ℃～4 ℃下保存待用。 B.2.2 显色反应 取透明度较好的5 mL离心管4支，2支为测定管，2支为对照管，1支做光反应对照，1支做空白（对 照、空白不加酶液，以缓冲液代替）。按表B.1依次加入各溶液： 表B.1 各溶液显色反应用量 6 试剂 用量/mL 终浓度 0.05 M 磷酸缓冲液 1.5 – 130 mM Met 0.3 13 mM 750 μM NBT 0.3 75 μM 100 μM EDTA-N