ICS 65.020.30 B 41 备案号：55651-2017 内 蒙 DB15 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1238—2017 绵羊肺腺瘤病毒双抗体夹心 ELISA 检测 技术 Detection of double antibody sandwich ELISA for envelope protein of jaagsiekte sheep retrovirus (JSRV ) 2017-09-10 发布 内蒙古自治区质量技术监督局 2017-12-10 实施 发 布 DB15/T 1238—2017 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 缩略语 ............................................................................ 1 5 试剂 .............................................................................. 2 6 材料与设备 ........................................................................ 2 7 样品前处理 ........................................................................ 2 8 操作方法 .......................................................................... 2 9 结果判断 .......................................................................... 3 附录 A（规范性附录） 试剂配制目录 .................................................... 5 I DB15/T 1238—2017 前 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由内蒙古质量技术监督局提出并归口。 本标准主要起草单位：内蒙古农业大学。 本标准起草人：刘淑英、刘月。 II 言 DB15/T 1238—2017 绵羊肺腺瘤病毒双抗体夹心 ELISA 检测技术 1 范围 本标准规定绵羊肺腺瘤病毒双抗体夹心ELISA检测技术的试剂、材料与设备、样品前处理、操作方 法、结果判定等。 本标准适用于内蒙古自治区检测临床疑似病羊、进出境种羊外周血液样品中绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋 白，和羊临床样品中绵羊肺腺瘤病病原的快速检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 绵羊肺腺瘤病毒 Jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV 绵羊肺腺瘤病毒（JSRV）是引起绵羊肺腺瘤病（OPA）的病原。该病毒属单股正链 RNA 逆转录病毒， 其病毒的囊膜蛋白是具有转化细胞和致癌功能的蛋白质，位于病毒粒子的最外层，是构成病毒粒子的主 要结构蛋白。 3.2 双抗体夹心 ELISA 技术 double antibody sandwich ELISA 指特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检血清中的相应抗原结合形成免疫复合 物，洗涤后再加酶标抗体，与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体—抗原—固相抗体复合物显色来检测 抗原含量的技术。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件： a) JSRV：绵羊肺腺瘤病毒（Jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV）； b) exJSRV：外源性绵羊肺腺瘤病毒( exogenous jaagsiekte sheep retrovirus，exJSRV )； c) enJSRV：内源性绵羊肺腺瘤病毒（endogenous jaagsiekte sheep retrovirus，enJSRV ）； d) OPA：绵羊肺腺瘤病（ovine pulmonary adenomatosis，OPA）； 1 DB15/T 1238—2017 e) f) g) h) ELISA：酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）； PBS：抗体样品稀释液(磷酸盐缓冲液,Phosphate Buffered Saline，PBS）； PBST：洗涤液(PBS+Tween-20，PBST)； HRP：辣根过氧化物酶（hydrogen-peroxide oxidoreductase，HRP）。 5 试剂 5.1 除非另有说明，在检测中使用的化学试剂均为分析纯，实验室用水应符合 GB/T 6682 中三级水的 要求。 5.2 红细胞裂解液（配制见附录 A 中 A.1）。 5.3 抗体样品稀释液（配制见附录 A 中 A.2）。 5.4 包被缓冲液（配制见附录 A 中 A.3）。 5.5 包被抗体（配制见附录 A 中 A.4）。 5.6 检测抗体（配制见附录 A 中 A.5）。 5.7 洗涤液（配制见附录 A 中 A.6）。 5.8 封闭液（配制见附录 A 中 A.7）。 5.9 TMB 底物显色液（配制见附录 A 中 A.8）。 5.10 底物终止液 2M H2SO4（配制见附录 A 中 A.9）。 6 材料与设备 6.1 1000 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 微量加样器。量程分别 0.2 μL～2 μL、1 μL～10 μL、10 μL～100 μL、20 μL～200 μL 和 100 μL～ μL 的移液器，并配备与移液器相匹配的吸头。 4 ℃～ -20 ℃冰箱。 电热恒温培养箱。 96 孔酶标板。 自动酶标检测仪。 旋涡振荡器。 7 样品前处理 取新鲜抗凝血5 mL，3000 r/min离心15 min，弃上清，按1: 5的比例向细胞沉淀中加入冰箱预冷的 红细胞裂解液混匀，4 ℃静置10 min，期间上下颠倒混匀5次，1000 r/min离心5 min，离心弃去上层红 色液体，收集沉淀部分。如果沉淀还有红色，可重新加入红细胞裂解液，重复1遍；向沉淀中加入样品 稀释液200 μ L，反复冻融或室温静置1 h使细胞破裂，期间不时在旋涡振荡器上混合；1000 r/min离心 5 min，取上清液进行检测。 8 操作方法 8.1 包被 ELISA 板每孔加 100 μ L 包被缓冲液稀释过的包被抗体（浓度约 0.0386 mg/mL） ，4 ℃下过夜包被。 2 DB15/T 1238—2017 8.2 洗涤 用滤纸拍干，用PBST液洗板5次。 8.3 封闭 ELISA 板每孔加入封闭液200 μ L，37 ℃下孵育1 h。 8.4 洗涤 用滤纸拍干，用PBST液洗板5次。 8.5 加待检样品 ELISA 板每孔加待检样品 100 μ L，37 ℃下孵育 1 h。加入阳性对照，阴性对照和 PBS 空白对照。 注：阳性对照是鉴定为自然感染JSRV病毒的绵羊肺腺瘤病肺组织提取蛋白，阴性对照为未感染绵羊肺腺瘤病的绵羊 健康肺组织提取蛋白. 8.6 洗涤 用滤纸拍干，用PBST 液洗板5次。 8.7 加酶标抗体 ELISA 板每孔加稀释过的酶标抗体 100 μ L（浓度约为 0.0116 mg/mL） ，37 ℃下孵育 1 h。 8.8 洗涤 用滤纸拍干，用PBST液洗板5次。 8.9 显色 ELISA板每孔加TMB显色液100 μ L，避光15 min～30 min。 8.10 终止 ELISA板每孔加终止液100 μ L。 8.11 读值 终止反应后将ELISA板置于自动酶标仪上，在450 nm波长下读取光吸收OD值。 9 结果判断 9.1 结果分析条件设定 阳性对照平均 OD 值与阴性对照平均 OD 值的比值大于 2.1，空白对照平均 OD 值小于或等于阴性对 照平均 OD 值，检测结果有效。否则应检查实验操作并进行重测。 9.2 阳性判定标准 被检样品 OD 值与阴性对照 平均 OD 值的比值大于等于 2.1 判定为阳性。 3 DB15/T 1238—2017 9.3 阴性判定标准 被检样品 OD 值与阴性对照平均 OD 值的比值小于 2.1 判定为阴性。 4 DB15/T 1238—2017 AA 附 录 A （规范性附录） 试剂配制目录 A.1 红细胞裂解液 NH4CL 8.29 g，KHCO3 1.00 g，Na2EDTA 37.2 mg溶于1000 mL蒸馏水，调pH 至7.4。 A.2 抗体样品稀释液 NaCl 8.0 g ，KH2PO4 0.27 g，Na2HPO4 1.42 g，KCl 0.2 g 溶于1000 mL蒸馏水，调pH 至 7.4。 A.3 包被缓冲液 Na2CO3 1.599 g，NaHCO3 2.939 g，溶解于800 mL去离子水中，调节pH至9.6，定容到l L,4 ℃保存 备用。 A.4 包被抗体 JSRV囊膜蛋白抗原表位富集区段的蛋白作为抗原，按常规方法免疫新西兰白兔，制备包被抗体。 A.5 酶标抗体 JSRV囊膜蛋白抗原表位特异区段的蛋白作为抗原，按常规方法免疫小鼠，制备检测抗体。用HRP标 记试剂盒标记检测抗体，制备酶标抗体。 A.6 洗涤液 1L PBS溶液加入0.5 mL吐温20（Tween-20）室温保存。 A.7 封闭液 含10 %脱脂乳的PBST溶液。 A.8 TMB底物显色液 底物显色A液：醋酸钠13.6 g，柠檬酸1.6 g，H2O2（30%）0.3 mL，