ICS 67.080.01 B 31 DB13 河 北 省 地 方 标 准 DB13/T 2456—2017 番茄苗期抗黄化曲叶病 毒基因快速检测技术规程 2017 - 03 - 29 发布 河北省质量技术监督局 2017 - 06 - 01 实施 发 布 DB13/ T 2456—2017 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由河北省农林科学院提出。 本标准起草单位：河北省农林科学院经济作物研究所。 本标准主要起草人：吴志明、李亚栋、耿保进、高慧敏、田玉、孙英焘、孙世卫、寇慧苹、冯贺 敬。 I DB13/ T 2456—2017 番茄苗期抗黄化曲叶病毒基因快速检测技术规程 1 范围 本标准规定了番茄苗期抗黄化曲叶病毒基因的检测前准备和检测技术。 本标准适用于番茄苗期抗黄化曲叶病毒基因Ty-1、Ty-2、Ty-3/3a的分子快速检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 番茄黄化曲叶病毒病（Tomato yellow leaf curl virus disease） 为病毒性病害，病原为番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV or TY）， 病原特征及发病症状见附录C。 2.2 番茄抗黄化曲叶病毒基因 2.2.1 番茄抗黄化曲叶病毒基因Ty-1 定位在番茄第6号染色体上(基因号)。 2.2.2 番茄抗黄化曲叶病毒基因Ty-2 定位在番茄第11号染色体上。 2.2.3 番茄抗黄化曲叶病毒基因Ty-3/3a 定位在番茄第6号染色体上。 3 检测前准备 3.1 检测仪器 组织研磨仪、恒温水浴锅、离心机、高压灭菌锅、移液器、称量天平、冰箱(4 ℃、-20 ℃、 -80 ℃)、 电泳仪、紫外凝胶成像仪、PCR仪等。 3.2 检测试剂 DNA提取液(CTAB)、氯仿/异戊醇(24/1)、乙醇、异丙醇、蒸馏水、双蒸馏水（ddH2O）、TE缓冲液 (Ph=8.0)、50 x TAE缓冲液、Goldview、DM2000、琼脂糖、Taq 酶等。 3.3 检测引物 1 DB13/T 2456—2017 表1给出了抗TYLCV的抗病基因扩增引物。 表 1 Ty-1、Ty-2 和 Ty-3/3a 检测引物 基因 Ty-1 Ty-2 Ty-3/3a 染色体 引物 序列(5′-3′) Ty1 正向 TGTATGCGTCGTGTTAGAAGGTC Ty1 反向 AATGGTGACAGAATCAAGATCCAC Ty1-3 AAACGCTCTTCTTCCCCTCG Ty1-4 AGTTAGATTCAGGCTCCTCGCA Ty2 正向 AAAATGTTCGTCTCTTTTAATCATAC Ty2 反向 AGTGTACATCCTTGCCATTGACT Ty3 正向 GGTAGTGGAAATGATGCTGCTC Ty3 450（抗） Ty3 反向 GCTCTGCCTATTGTCCCATATATAACC Ty3a630（抗） 6 11 扩增产物(bp) 标记类型 984（抗） 1434（感） SNP 194（抗） 494（感） SCAR 320（感） SCAR 6 3.4 DNA 提取液配制 配制以下DNA提取液： a) 100 mmol/L Tris (pH=8.0)； b) 50 mmol/L EDTA； c) 500 mmol/L NaCl； d) 2 %CTAB（W/V）； e) 0.8 %皂土（W/V）。 4 检测技术 4.1 样品采集和保存 采集定植前番茄苗至少3个样本，每个样本随机选取3～5株，进行编号、保存。 短期保存温度4 ℃，长期保存温度-20 ℃或-80 ℃。 4.2 DNA 提取 DNA提取按下列步骤进行： a) 在 2 mL 离心管加入 0.2 g 左右样本、一粒磨样珠，用磨样机研磨成匀浆； b) 加入 600 μ l 65 ℃预热的 DNA 提取液，65 ℃保温 30 min 以上； c) 加入 600 μ l 氯仿/异戊醇（24/1），上下颠倒混匀数次，室温静置 5 min； d) 6000 rpm 以上室温离心 10 min，吸取上清液 400 μ L 至 1.5 ml 离心管中，加入等体积的异丙 醇，上下颠倒混匀，室温静置 5 min； e) 10000 rpm 以上离心 10 min，弃上清液； f) 加入 1 ml 70 %乙醇洗涤，用手指轻弹使沉淀漂浮于乙醇中； g) 6000 rpm 以上离心 5 min，弃上清液，将离心管倒扣在滤纸上，风干 DNA； h) 加入 50 μ L TE 缓冲液； 2 DB13/ T 2456—2017 i) 完全溶解后，取 4 μ L DNA 进行 1%的琼脂糖凝胶电泳分析，剩下的置于-20 ℃或-80 ℃冰箱 中保存。 4.3 Ty-1、Ty-2 和 Ty-3/3a 检测 4.3.1 PCR 检测反应体系 PCR反应液体积为20 μ L，组分配制应符合表2的规定。 表 2 PCR 反应体系 反应组分 原浓度 终浓度 反应体积 μ L DNA 30 ng/μ L～50 ng/μ L 1.5 ng/μ L～2.5 ng/μ L 1 10×buffer 10×buffer 1×buffer 2 dNTP 2.5 mmol/L 0.15 mmol/L 1.6 Taq 酶 5 U/μ L 0.2U/μ L 0.2 正向引物 10 μ mol/L 0.5 μ mol/L 1 反向引物 10 μ mol/L 0.5 μ mol/L 1 ddH2O --- --- 13.2 4.3.2 Ty-1、Ty-2 和 Ty-3/3a PCR 反应程序 按下列程序进行操作： a) 94 ℃预变性5 min； b) 94 ℃变性50 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min30 s，共5个循环； c) 94 ℃变性50 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共30个循环； d) 72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。 4.3.3 电泳检测 采用1.5 %（w/v）琼脂糖凝胶电泳进行检测。用紫外凝胶成像仪记录电泳结果。 5 检测结论与检测报告 5.1 检测结论判定依据检测结果进行，检测结果显示为电泳图谱。电泳图谱见附录 A。 5.2 填写检测报告，检测报告式样见附录 B。 3 DB13/T 2456—2017 附 录 A （规范性附录） 电泳图谱 注：Ty-1 纯合体显示 984 bp 条带，感病纯合体显示 1343 bp 条带，而杂合体显示 984 bp 和 1343 bp 条带。 图 A.1 Ty-1 抗病基因检测电泳图谱 注：Ty-2 纯合体显示 194 bp 条带，感病纯合体显示 494 bp 条带，而杂合体显示 194 bp 和 494 bp 条带。 图 A.2 Ty-2 抗病基因检测电泳图谱 注：Ty-3 a 纯合体显示 630 bp 条带，Ty-3 纯合体显示 450 bp 条带，感病纯合体显示 320 bp 条带，而 Ty-3 /Ty3a 的杂合体分别显示 630/450 bp 和 320 bp 条带。 图 A.3 Ty3/Ty3a 抗病基因电泳图谱 4 DB13/ T 2456—2017 附 录 B （规范性附录） 检测报告式样 表 B.1 检测报告式样 番茄苗期抗黄化曲叶病毒基因快速检测报告 共 样品名称： 样品编号： 样品数量： 样品性状： 页，第 页（附图 页） 检验项目： 检验依据： 主要仪器设备： 检验条件： 检验时间： 送检单位： 送样时间： 联系地址： 联系电话： 检验内容及结果： 1、 受检样品性状 …… 2、 检验方法 …… 3、 结果 …… 4、 结论 …… 承检单位： 地址： 邮政编码： 联系人： 联系电话： 主检人： 技术负责人： 检验日期： 年 月 日 5 DB13/T 2456—2017 附 录 C （资料性附录） 番茄黄化曲叶病病原特征及发病表现 中 国 番 茄 黄 化 曲 叶 病 毒 (Tomato yellow leaf curl virus ， TYLCV) ， 属 于 双 生 病 毒 科 （Geminiviridae），菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）病毒，因该属病毒在自然条件下只能由烟 粉虱（Bemisia tabaci）以持久方式传播，又被称为粉虱传双生病毒，是一类具有孪生颗粒形态的植 物DNA 病毒 植株矮化，生长缓慢或停滞，顶部叶片常稍褪绿发黄、变小，叶片边缘上卷，叶片增厚，叶质变 硬，叶背面叶脉常显紫色。生长发育早期染病植株严重矮缩，无法正常开花结果；生长发育后期染病 植株仅上部叶和新芽表现症状，结果数减少，果实变小，成熟期果实着色不均匀(红不透)，基本失去 商品价值。 _________________________________ 6