ICS 11.220 B 41 备案号：56318-2017 吉 林 DB22 省 地 方 标 准 DB 22/T 2705—2017 牛瑟氏泰勒虫病检测方法 LAMP 法 LAMP assay for detection of bovine Theileria sergenti 2017 - 09 - 30 发布 吉林省质量技术监督局 2017 - 11 - 30 实施 发 布 DB22/T 2705—2017 前 言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 和 GB/T 20001.4—2015 给出的规则起草。 本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本标准起草单位：延边大学、吉林省动物疫病预防控制中心、延边朝鲜族自治州畜牧总站。 本标准主要起草人：贾立军、张守发、梁晚枫、柴方红、张魁、王海军。 I DB22/T 2705—2017 牛瑟氏泰勒虫病检测方法 LAMP 法 1 范围 本标准规定了牛瑟氏泰勒虫病 LAMP 检测方法的技术要求。 本标准适用于牛瑟氏泰勒虫病原检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682—2008 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 3.1 瑟氏泰勒虫病 theileria sergenti 由泰勒科、泰勒属的瑟氏泰勒虫寄生于牛体内引起的以高热、贫血、出血、消瘦和体表淋巴结肿大 为主要临床症状的一种血液原虫病。 4 原理 环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification LAMP)：针对靶基因的6个区域设计4 种特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶在62 ℃～65 ℃等温条件下， 保温30 min～60 min，使得链 置换DNA合成在不停地自我循环，即而完成的核酸扩增反应。 5 试剂和溶液 除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T 6682中一级水的要求。 5.1 5.1.1 5.1.2 5.1.3 5.1.4 5.1.5 5.1.6 5.2 试剂 Bst DNA Polymerase。 SYBR GreenⅠ。 限制性内切酶 TaqⅡ。 血液 DNA 提取试剂盒。 溴化乙锭。 DNA Marker 分子量标准。 常规试剂配制 1 DB22/T 2705—2017 5.2.1 5.2.2 5.2.3 5.2.4 5.2.5 5.2.6 5.2.7 5.2.8 5.3 100 mg/mL 溶菌酶见附录 A.1。 10 mg/mL 蛋白酶 K 见附录 A.2。 10% 十二烷基磺酸钠见附录 A.3。 5% 十六烷基三甲基溴化铵见附录 A.4。 TE（pH 8.0）见附录 A.5。 50×TAE 缓冲液见附录 A.6。 加样缓冲液见附录 A.7。 1.5%琼脂糖凝胶的制备见附录 A.8。 引物 LAMP反应引物序列与浓度见表1。 表1 引物 LAMP 特异性引物序列及浓度 引物序列 F3 TCGCCCACAGACTTAAGCA B3 GAATGGTCCGACGAAGTCAT FIP GTGCATATCCGAACTGAACCCACTCATGCCAAGCCACTCT BIP AGGAAACCAAGGATCTCGATGCGGCATCAGCAGCAAAAAGAC 5.4 浓度 0.2µmol/L P33 基因 0.2µmol/L （D87198） 1.6µmol/L 1.6µmol/L 仪器设备 5.4.1 5.4.2 5.4.3 5.4.4 5.4.5 5.4.6 5.4.7 5.5 DNA 序列 低温高速离心机，12 000 r/min。 恒温水浴锅，室温～100 ℃。 分析天平，感量 0.1 mg。 电泳槽，水平电泳槽。 电泳仪，电压 1 V～300 V，电流 1 mA～400 mA。 凝胶成像系统（带紫外灯）。 微量加样器，单道 2 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL 和 1000 μL。 试验样品 对无菌采集的待检牛血液样品，封装于洁净塑料离心管或玻璃试管内，编号。冷藏条件下送实验室 检测。 5.6 标准样品 标准阳性样品为牛瑟氏泰勒虫基因组DNA提取物，DNA浓度为10 mg～30 mg。制备方法见附录B。标 准阴性样品为无瑟氏泰勒虫感染牛血液DNA提取物，DNA浓度为10 mg～30 mg。 6 试验步骤 6.1 6.2 6.3 2 LAMP 反应体系，按表 2 依次加入反应试剂，总体系 25 µL。 同时设置阳性对照、阴性对照和水对照。 LAMP 反应条件，63 ℃反应 60 min，80 ℃ 2 min 终止反应。 DB22/T 2705—2017 表2 LAMP 反应体系 加样物 浓度 体积 DNA 模板 10 mg～30 mg 2 µL MgSO4 6.0 mmol/L 3 µL dNTP 1.4 mmol/L 3.5 µL F3 0.2 µmol/L 1 µL B3 0.2 µmol/L 1 µL FIP 1.6 µmol/L 1 µL BIP 1.6 µmol/L 1 µL Bst DNA Polymerase Buffer 10× 2.5 µL Bst DNA Polymerase 8 U/µL 1 µL ddH2O 9 µL 总体系 7 7.1 25 µL 结果判定 眼观判定 将样品反应物加入1000倍 SYBR Green I 2 µL，室温放置10 min，置于凝胶成像仪的紫外灯下观察。 阳性对照样品应呈现绿色荧光，阴性对照与水对照样品应呈现棕色、无荧光。在对照成立的前提下，样 品呈现绿色荧光判为阳性，呈现棕色、无荧光判为阴性。具体参考标准见附录C.1。 7.2 电泳判定 取样品反应物2 µL加入到1.5%琼脂凝胶板的样品孔中，并设置标准阳性、阴性和标准分子量DNA Marker。将凝胶在150 V恒定电压下电泳30 min后，置于凝胶成像仪观察。阳性样品应呈现特征性梯状 条带，阴性样品无条带。具体见附录C.2。 3 DB22/T 2705—2017 AA 附 录 A （规范性附录） 环介导等温扩增（LAMP）常用溶液配制 A.1 100 mg/mL溶菌酶 100 mg/mL溶菌酶的配制见表A.1。 表A.1 100 mg/mL 溶菌酶 溶菌酶 100 mg 灭菌双蒸水 A.2 定容至 1 mL 10 mg/mL蛋白酶K 10 mg/mL 蛋白酶K的配制见表A.2。 表A.2 10 mg/mL 蛋白酶K 蛋白酶 K 10 mg 灭菌双蒸水 A.3 定容至 1 mL 10% 十二烷基磺酸钠（SDS） 10% 十二烷基磺酸钠（SDS）的配制见表A.3。 表A.3 10% 十二烷基磺酸钠（SDS） 十二烷基磺酸钠（SDS） 10 g 灭菌双蒸水 定容至 100 mL 注：分装，灭菌，室温保存。 A.4 5% 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB） 5% 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）的配制见表A.4。 表A.4 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB） 灭菌双蒸水 A.5 5% 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB） 0.5 g 定容至 10 mL TE（pH 8.0） 10 mmol/L的Tris-HCl(pH 8.0)与1 mmol/L的EDTA（pH 8.0）等体积混合，高压灭菌。 4 DB22/T 2705—2017 A.6 50×TAE缓冲液 A.6.1 0.5 mol/L乙二铵四乙酸（EDTA）（pH 8.0）的配制见表A.6。 表A.6 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸（EDTA）（pH 8.0） 乙二铵四乙酸二钠 18.6 g 灭菌双蒸水 80 mL 注：用氢氧化钠溶液调pH至8.0，灭菌双蒸水定容至100 mL。 A.6.2 TAE缓冲液（50×）的配制见表A.7。 表A.7 TAE 缓冲液（50×）配制 三羟甲基氨基甲烷（Tris） 24.2 g 冰乙酸 5.71 mL 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸（EDTA）（pH 8.0） 10 mL 注：加去离子水定容至 100 mL，室温保存备用，使用时稀释 50×为工作液。 A.7 加样缓冲液 加样缓冲液的配制见表A.8。 表A.8 加样缓冲液 溴酚蓝 10 mg 甘油 2.5 mL 0.5 mol/L pH 6.8 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液 A.8 定容至 10 mL 1.5%琼脂糖凝胶 1.5%琼脂糖凝胶的制备见表A.9。 表A.9 琼脂糖 1×TAE 缓冲液 1.5%琼脂糖凝胶的制备 1.5 g 定容至 100 mL 将三角瓶放在沸水浴或微波炉中加热至琼脂糖充分溶解（注意用微波炉加热时不要沸出），置室温 冷却到50 ℃左右，加入10 mg/mL的溴化乙锭10 μL，摇匀，倒入电泳板上，凝固，4℃备用。 5 DB22/T 2705—2017 BB 附 录 B （规范性附录） 标准阳性对照模板 DNA 制备 标准阳性对照模板DNA制备应： a) 取牛瑟氏泰勒虫病阳性血液 150 µL 加入 1.5 mL 离心管中，加入溶菌酶（100 mg/mL）15 µL， 充分混匀，37 ℃下 1 h； b) 依次加入蛋白酶 K(10 mg/ml) 9 µL、10% SDS 105 µL、5 mol/L NaCl 150 µL、5% CTAB 240 µL， 充分混匀后，65 ℃下 10 min； c) 加入等体积 Tris-饱和酚和氯仿反复抽提两次，氯仿洗涤一次； d) 取上层于另一 1.5 mL 离心管中，加入等体积无水乙醇和 1/10 体积醋酸钠沉淀 30 min； e) 4 ℃下 12 000 r/min 离心 15 min，弃上清； f) 将 70%乙醇 100 µL 沿管壁徐徐加入，4 ℃下 12 000 r/min 离心 1 min，吸弃上清，干燥； g) 用 20 µL TE 溶解 DNA，取一部分测定 OD260 和 OD280，以计算所提的 DNA 浓度和纯度，其余 基因组总 DNA 于-20 ℃保存、备用。 6 DB22/T 2705—2017 CC 附 录 C （规范性附录） LAMP 扩增结果判定标准 眼观判定LAMP扩增标准见图C.1。 1 2 说明： 1——标准阳性对照； 2