ICS 65.120 B 46 备案号：56308-2017 吉 林 DB22 省 地 方 标 准 DB 22/T 2695—2017 饲料中林可霉素、红霉素的测定 液相色谱-质谱/质谱法 Determination of lincomycin and erythromycin in feeds-LC-MS/MS method 2017 - 09 - 30 发布 吉林省质量技术监督局 2017 - 11 - 30 实施 发 布 DB22/T 2695—2017 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 和 GB/T 20001.4-2015 给出的规则起草。 本标准由中国人民共和国吉林出入境检验检疫局提出并归口。 本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心。 本标准主要起草人：胡婷婷、赵韫慧、宋清莲、顾婷婷、曹海微、李荣荣。 I DB22/T 2695—2017 饲料中林可霉素、红霉素的测定 液相色谱-质谱/质谱法 1 范围 本标准规定了饲料中林可霉素、红霉素 液相色谱-质谱/质谱测定方法的原理、试剂或材料、仪器 设备、样品、试验步骤、试验数据处理、精密度及试验报告。 本标准适用于配合饲料、预混饲料及浓缩饲料中林可霉素、红霉素的测定。 本方法饲料中林可霉素、红霉素的检出限0.3 μg/kg，定量限为1.0 μg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料 采样 GB/T 20195 动物饲料 试样的制备 3 原理 样品中的林可霉素、红霉素用甲醇提取，饱和乙酸铅溶液除蛋白，经 N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基 苯固相萃取柱净化，液相色谱-质谱/质谱仪测定，外标法定量。 4 试剂或材料 除另有规定，仅用分析纯试剂。 4.1 水，GB/T 6682，一级。 4.2 林可霉素标准物质：Lincomycin，C33H50Cl3N5O8S，CAS 号：154-21-2。 4.3 红霉素标准物质：Erythromycin，C37H67NO13，CAS 号：114-07-8。 4.4 磷酸二氢钾（KH2PO4）。 4.5 三水合乙酸铅（C4H6O4Pb·3H2O）。 4.6 甲醇（CH3OH）：色谱级。 4.7 乙腈（CH3CN）：色谱级。 4.8 盐酸（HCl）。 4.9 甲酸（HCOOH）。 4.10 0.1 mol/L 盐酸：量取 8.2 mL 盐酸（4.8）至烧杯中，加少量水稀释，将稀释后的溶液转移到 1 000 mL 的容量瓶中，加水至刻度，摇匀。 4.11 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲溶液（pH 8.0）：称取 17.9 g 磷酸二氢钾（4.4），溶于 450 mL 水中， 用盐酸溶液（4.10）调节 pH 值至 8.0，加水定容至 500 mL。 4.12 饱和乙酸铅溶液：在 50 mL 水中加入一定量的三水合乙酸铅（4.5），超声 5 min，直至固体不 再溶解。 4.13 甲醇溶液（3+7，V/V）：量取 30 mL 甲醇和 70 mL 水，混匀。 1 DB22/T 2695—2017 4.14 0.1%甲酸溶液：量取 1 mL 甲酸（4.9）和 999 mL 水，混匀。 4.15 定容液：量取 95 mL0.1%甲酸溶液（4.14）和 5 mL 乙腈（4.7），混匀备用。 4.16 标准储备溶液：分别准确称取林可霉素、红霉素标准品 100 mg（精确到 0.1 mg），用甲醇溶解 并定容于 100 mL 棕色容量瓶中，配制成浓度为 1 000 µg/mL 的标准储备液，-18 ℃条件下保存 6 个月。 4.17 混合标准工作液：准确移取一定体积的标准储备溶液（4.16），根据需要用定容液（4.15）稀释 成林可霉素、红霉素混合标准工作液，现用现配。 4.18 N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯固相萃取柱：200 mg/6 mL 或相当者。使用前依次用 5 mL 甲醇、 5 mL 水及 5 mL0.1 mol/L 磷酸盐缓冲溶液（4.11）活化。 4.19 滤膜：0.22 µm，有机系。 5 仪器设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 液相色谱-质谱/质谱仪：配备电喷雾离子源（ESI）。 天平：感量为 0.01 g 和 0.0 001 g。 样品粉碎机。 高速离心机：10 000 r/min。 氮吹仪。 超声波清洗机。 涡旋混合器。 旋转蒸发仪。 6 样品 6.1 6.2 7 按 GB/T 14699.1 的规定抽取有代表性的样品，用四分法缩减取样。 按照 GB/T 20195 的规定制备样品，粉碎过 0.45 mm 孔径筛，混合均匀，装入磨口瓶中备用。 试验步骤 7.1 提取 称取1 g（精确至0.01g）饲料样品于50 mL具塞离心管中，加入10 mL甲醇，充分涡旋混合1 min， 超声提取10 min，于10 000 r/min速率下离心5 min，收集上清液于鸡心瓶中；残渣中再加入10 mL甲醇 重复提取1次，合并两次提取液，于35℃下旋转蒸发至近干后，加入5 mL 0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液（4.11） 涡旋溶解，将提取液移至玻璃试管中，再用2 mL 0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液（4.11）充分洗涤鸡心瓶， 合并提取液，在提取液中加入100 μL饱和乙酸铅溶液（4.12），涡旋、离心后，取上清液，待净化。如 遇高浓度样品，请适当稀释后再进行净化步骤。 7.2 净化 将7.1中的待净化液转移至活化后的N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯固相萃取柱（4.18）中。依次用 5 mL水和5 mL甲醇溶液（4.13）洗涤，抽至近干后用5 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，整个固相萃取过程流 速不超过1 mL/min。洗脱液于50 ℃下用氮气吹至近干，残留物中准确加入1.0 mL定容液（4.15），混 合均匀后，过0.22 m滤膜，供液相色谱-质谱/质谱仪（5.1）测定。 7.3 2 空白试验 DB22/T 2695—2017 除不加样品外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。 7.4 测定 7.4.1 色谱参考条件 色谱参考条件如下： a) 色谱柱： C18 色谱柱， 2.1 mm ×150 mm，3.5 μm 或相当者； b) 流动相：A:0.1%甲酸溶液；B：乙腈；梯度洗脱条件参见表 1； c) 流速：0.25 mL/min； d) 进样量：10 L。 表1 7.4.2 梯度洗脱条件 时间 min A % B % 0.0 95 5 1.0 95 5 6.0 40 60 6.1 5 95 12.0 5 95 12.1 95 5 18.0 95 5 质谱参考条件 本标准所使用的质谱参考条件如下： a) 电离方式：电喷雾电离（ESI）； b) 扫描方式：正离子扫描，多反应监测（MRM）； c) 喷雾电压：5.5 kV； d) 离子源温度：550 ℃； e) 气帘气压力（CUR）：0.75 MPa； f) 雾化气压力：1.5 MPa； g) 辅助气压力：1.5 MPa； h) 定性离子对、定量离子对、去簇电压、碰撞能量见表 2。 表2 化合物 林可霉素 红霉素 林可霉素、红霉素定性离子对、定量离子对、去簇电压和碰撞能量 准分子离子 子离子 碰撞能量 去簇电压 407.4 126.2* 38 60 407.4 359.3 25 60 716.7 158.3* 42 60 716.7 558.7 21 60 注：加“*”的为定量离子。 3 DB22/T 2695—2017 7.4.3 标准工作曲线 将浓度分别为 1.0 µg/L、2.0 µg/L、5.0 µg/L、20.0 µg/L、100.0 µg/L 的林可霉素和红霉素标准 工作溶液，按参考色谱和质谱条件测定。以林可霉素或红霉素质量浓度为横坐标，相应的峰面积响应值 为纵坐标，进行线性回归分析。 7.4.4 定性分析 在同一色谱/质谱条件下进行标准溶液和样品溶液的测定，如果样品溶液中检出的色谱峰的保留时 间与标准物质色谱峰的保留时间一致，所选择的两对子离子的质荷比也一致，而且样品定性离子的相对 丰度与浓度相当标准工作溶液的定性离子的相对丰度相比较，相对偏差不超过表3规定的范围，则可判 定样品中存在该物质。标准溶液的多反应监测色谱图参见附录A。 表3 定性分析时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度/% ＞50 ＞20～50 ＞10～20 ≤10 允许的相对偏差/% ±20 ±25 ±30 ±50 7.4.5 定量测定 平行做两份测定。标准工作液和样液中被测组分的响应值均应在仪器线性响应范围内。在上述色谱 条件下，林可霉素和红霉素的参考保留时间分别为7.21 min，9.83 min，外标法定量。标准溶液的多反 应监测色谱图参见附录A。 8 试验数据处理 用色谱数据处理机或按公式（1）计算样品中林可霉素、红霉素残留含量，计算结果需扣除空白值。 X  c V ……………………….………………… (1) m 式中： X —— 样品中被测组分含量，单位为微克每千克 （g/kg）； c —— 被测组分溶液浓度，单位为微克每升（g/L）； V —— 样液最终定容体积，单位为毫升 （mL）； m —— 样液所代表的最终样品的质量，单位为克 （g）； 计算结果保留三位有效数字。 9 精密度 9.1 重复性 在同一实验室，由同一操作者使用相同设备，按相同的测试方法，并在短时间内对同一被测对象相 互独立进行测试获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的 15%，以大于 这两个测定值的算术平均值的 95% 的情况不超过 5%为前提。 9.2 4 再现性 DB22/T 2695—2017 在不同的实验室，由不同的操作者使用不同的设备，按相同的测试方法，对同一被测对象相互独立 进行测试获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的 20%，以大于这两个 测定值的算术平均值的 95% 的情况不超过 5%为前提。 10 试验报告 试验报告至少应给出以下几个方面的内容： i) 试验对象； j) 所使用的标准（包括发布或出版年号）； k) 所使用的方法（如果标准中包括几个方法）； l) 结果； m) 观察到的异常现象； n) 试验日期。