ICS 11.220 B 41 备案号：56317-2017 吉 林 DB22 省 地 方 标 准 DB 22/T 2704—2017 牛卵形巴贝斯虫病检测方法 PCR 法 PCR assay for detection of bovine Babesia ovata 2017 - 09 - 30 发布 吉林省质量技术监督局 2017 - 11 - 30 实施 发 布 DB22/T 2704—2017 前 言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 和 GB/T 20001.4—2015 给出的规则起草。 本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本标准起草单位：延边大学、吉林省动物疫病预防控制中心、延边朝鲜族自治州畜牧总站。 本标准主要起草人：贾立军、梁晚枫、柴方红、黄国明、张魁、王海军。 I DB22/T 2704—2017 牛卵形巴贝斯虫病检测方法 PCR 法 1 范围 本标准规定了牛卵形巴贝斯虫病 PCR 检测方法的技术要求。 本标准适用于牛卵形巴贝斯虫病原检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682—2008 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 3.1 卵形巴贝斯虫病 babesiosis 由牛卵形巴贝斯虫（Babesia ovata）寄生于牛的红细胞内，以高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿等 为主要特征的血液寄生虫病。 4 原理 双链DNA在高温加热的作用下变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则，通 过人工合成的特异性寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链，再利用反应 混合物中的四种脱氧核苷三磷酸(dNTPs)合成新生的DNA互补链，进而完成特定片段的体外扩增。 5 试剂和溶液 除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T 6682中一级水的要求。 5.1 5.1.1 5.1.2 5.1.3 5.1.4 5.2 5.2.1 5.2.2 试剂 Taq DNA 聚合酶。 dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）。 血液 DNA 提取试剂盒。 DNA Marker 分子量标准。 常规试剂配制 50×TAE 缓冲液见附录 A.1。 加样缓冲液见附录 A.2。 1 DB22/T 2704—2017 10 mg/mL 溴化乙锭见附录 A.3。 1%琼脂凝胶见附录 A.4。 5.2.3 5.2.4 5.3 引物 PCR反应引物序列与浓度见表1。 表1 引 物 PCR 反应引物序列与浓度 引物序列 上游引物 5’-GCCCGCAGGTCATCATAAAGT-3’ 下游引物 5’-CATTTTGTGCCAGCGTTTTG-3’ 5.4 DNA 序列 长度/bp 浓度/pmol/μL AB367928.1 1008 10 仪器设备 5.4.1 5.4.2 5.4.3 5.4.4 5.4.5 5.4.6 5.4.7 5.4.8 5.4.9 5.5 PCR 扩增仪,温度范围：4 ℃～100 ℃。 低温高速离心机,12 000 r/min 以上。 高压灭菌器,120 ℃ 以上。 恒温水浴锅,室温～100 ℃。 分析天平,感量 0.1 mg。 电泳槽,水平电泳槽。 电泳仪,电压 1 V～300 V；电流 1 mA～400 mA。 凝胶成像系统,带紫外灯。 微量加样器,单道 2 μL、10 μL、20 μL、100 μL 和 200 μL。 试验样品 对无菌采集的待检牛血液样品，封装于洁净塑料离心管或玻璃试管内，编号。冷藏条件下送实验室 检测。 6 试验步骤 6.1 模板 DNA 制备 按血液基因组DNA提取试剂盒操作说明书提取模板DNA见附录B。 6.2 检测血样 PCR 反应 在PCR反应管中按表2依次加入反应试剂，反应体系为 25 µL。反应条件为：95 ℃ 预变性 5 min； 94 ℃ 变性 50 s，50 ℃ 退火 60 s，72 ℃ 延伸 50 s，循环 30 次；72 ℃ 延伸 7 min，4 ℃ 保存。 表2 PCR 检测反应体系 试剂 体积 10×PCR 缓冲液 2.5 µL 2.5 mmol/L dNTP 2.0 µL 表 2（续） 2 DB22/T 2704—2017 试剂 体积 10 µmol/L 上游引物 1.0 µL 10 µmol/L 下游引物 1.0 µL 5 U/µL Taq 酶 0.25 µL 25 mg/L DNA 模板 2.0 µL 灭菌双蒸水 16.25 µL 总体积 25 µL 6.3 对照 PCR 反应 在试样PCR反应的同时，设置标准阴性对照、标准阳性对照和空白对照，各对照PCR反应体系中，除 模板外其余组分及PCR反应条件与6.2相同。以未感染卵形巴贝斯虫牛血液中提取的DNA作为标准阴性对 照PCR反应体系的模板；以卵形巴贝斯虫感染牛的血液提取的DNA作为标准阳性对照PCR反应体系的模板； 以无菌双蒸水作为空白对照PCR反应体系的模板。 7 7.1 结果判定 标准对照 标准对照见附录C。 7.2 检测样品判定 将所有样品、标准阳性对照、标准阴性对照及空白对照的PCR产物按编号加入到1%琼脂凝胶板的各 孔中，将凝胶的边孔中加入标准分子量DNA Marker，将凝胶在150 V恒定电压下电泳30 min后，凝胶成 像仪观察结果，判定如下： a) 在凝胶成像仪下，标准阴、阳性对照成立，若待检样品出现 1008 bp 的 DNA 带，判为阳性，记 作“+”，若无此带，记为“－”； b) 若标准阴、阳性对照不成立，则全部样品应重新检测。 3 DB22/T 2704—2017 AA 附 录 A （规范性附录） 聚合酶链式反应（PCR）试验常用试剂配制 A.1 50×TAE缓冲液 A.1.1 0.5 mol/L乙二铵四乙酸（EDTA）（pH 8.0）的配制见表A.1。 表A.1 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸（EDTA）（pH 8.0） 乙二铵四乙酸二钠 18.6 g 灭菌双蒸水 80 mL 氢氧化钠 调 pH 至 8.0 灭菌双蒸水 A.1.2 定容至 100 mL TAE缓冲液（50×）的配制见表A.2。 表A.2 TAE 缓冲液（50×）配制 三羟甲基氨基甲烷（Tris） 242 g 冰乙酸 57.1 mL 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸（EDTA） （pH 8.0） 10 mL 注：加去离子水定容至100 mL，室温保存备用，使用时稀释50×为工作液。 A.2 加样缓冲液 加样缓冲液的配制见表A.3。 表A.3 加样缓冲液 溴酚蓝 甘油 0.5 mol/L pH 6.8 的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液 A.3 10 mg/mL溴化乙锭 10 mg/mL溴化乙锭的的配制见表A.4。 4 10 mg 2.5 mL 定容至 10 mL DB22/T 2704—2017 表A.4 A.4 10 mg/mL 溴化乙锭 溴化乙锭 0.1 g 水（H2O） 定容至 10 mL 1%琼脂糖凝胶 1%琼脂糖凝胶的制备见表A.5。 表A.5 琼脂糖 1×TAE 缓冲液 1%琼脂糖凝胶的制备 1 g 定容至 100 mL 将三角瓶放在沸水浴或微波炉中加热至琼脂糖充分溶解（注意用微波炉加热时不要沸出），置室温 冷却到50 ℃左右，加入10 mg/mL溴化乙锭10 μL，摇匀，倒入电泳板上，凝固后，4 ℃备用。 5 DB22/T 2704—2017 BB 附 录 B （规范性附录） 样品 DNA 的制备 DNA提取试剂盒步骤： a) 在检测样品中加入 2 倍～3 倍体积的红细胞裂解液，充分颠倒混匀，12000 r/min 离心 1 min， 吸去上清，沉淀为白色或淡红色。向沉淀中加 200 μL 溶液 A，振荡至彻底混匀； b) 向悬浮液中加入 20 μL（10 mg/mL）的 RNase A，充分颠倒混匀，室温放置 10 min； c) 加入 20 μL（10 mg/mL）的蛋白酶 K，充分颠倒混匀，65 ℃ 水浴消化 30 min～60 min，消化 期间可颠倒离心管混匀数次，直至样品消化完全为止； d) 加入 2 倍体积溶液 B（已加入无水乙醇），充分颠倒混匀，将溶液加入吸附柱中，室温放置 2 min； e) 12000 r/min 离心 2 min，弃废液，将吸附柱放入收集管中； f) 向吸附柱中加入 700 μL 漂洗液（使用前加入无水乙醇），12000 r/min 离心 1 min，弃废液， 将吸附柱放入收集管中； g) 向吸附柱中加入 500 μL 漂洗液，12000 r/min 离心 1 min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 h) 12000 r/min 离心 2 min，将吸附柱敞口置于室温或 50 ℃温箱放置数分钟； i) 将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加 50 μL～200 μL 经 65 ℃水浴预热 的洗脱液，室温放置 5 min，12000 r/min 离心 1 min； j) 离心所得洗脱液再加入吸附柱中，12000 r/min 离心 2 min，即可得到高质量的基因组 DNA； k) 取一部分测定 OD260 和 OD280，以计算所提的 DNA 浓度和纯度，其余基因组总 DNA 于 4 ℃保存。 6 DB22/T 2704—2017 CC 附 录 C （规范性附录） 标准对照 标准对照见图C.1。 M 2 000 bp 1 000 bp 1 2 3 1008 bp 500 bp 200 bp 说明： M——DL 2000 DNA Marker； 1——标准阴性对照； 2——标准阳性对照； 3——空白对照。 图C.1 PCR 扩增标准阳性、阴性对照 ______________________ D E 7