ICS 65.020.40 B 61 DB51 四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 2404—2017 大熊猫种群遗传档案建立技术规程 2017 - 09 - 19 发布 四川省质量技术监督局 2017 - 10 - 01 实施 发 布 DB51/T 2404—2017 目 次 前 言 ............................................................................... II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 遗传标记选用原则 .................................................................. 1 5 实验流程 .......................................................................... 2 6 线粒体标记 PCR 方法 ................................................................ 2 7 大熊猫性别鉴定的方法 .............................................................. 3 8 微卫星标记使用方法 ................................................................ 4 9 遗传档案数据的管理和使用 .......................................................... 5 附录 A（规范性附录） 大熊猫微卫星标记编号、名称、来源及 PCR 扩增引物 .................. 6 I DB51/T 2404—2017 前 言 本标准根据:GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》的规定编写。 本标准由四川省林业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：四川省野生动植物资源保护管理站。 本标准主要起草人：岳碧松、魏辅文、张和民、沈富军、杨旭煜、古晓东。 II DB51/T 2404—2017 大熊猫种群遗传档案建立技术规程 1 范围 本标准规定了建立圈养大熊猫和野生大熊猫遗传档案的技术规程。 本标准适用于四川省圈养大熊猫和野生大熊猫遗传档案建立。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 DB51/T 2288-2016 野生大熊猫种群动态监测技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 微卫星序列 microsatellite sequence 是指基因组中由1-6个核苷酸为基本重复单元组成的DNA串联重复序列，例如（AC）n、（ACG）n、 （ATTT ）n等，也称为短串联重复序列（Short tandem repeats，STR）或简单重复序列（Simple sequences repeats，SSR）。在个体间重复次数发生变化的多态性微卫星位点，可以作为微卫星标记使用。 3.2 DNA 样品 DNA samples 是指利用大熊猫组织（如毛发、血液、精液、肌肉组织等）或新鲜粪便提取的大熊猫基因组 DNA。 4 4.1 遗传标记选用原则 线粒体标记 大熊猫线粒体控制区PCR扩增引物(Zhang et al. 2007): P-tp (5’-CTC CCT AAG ACT CAA GGA AG-3’) BEDH (5’-GGG TGA TCT ATA GTG TTA TGT CC-3’) PCR扩增产物长度为750bp左右。 4.2 性别鉴定分子标记 优先使用大熊猫锌指蛋白基因（ZF）PCR扩增引物（Xu et al., 2009）： GTf, 5’-CAAGGATTTCCATGTAGCAGT-3’ ； GTr, 5’-ACTCTCCACAATGTCTACGGT-3’ 1 DB51/T 2404—2017 如果用上述引物对某些样品扩增困难，可采用以下2对引物进行组合扩增（Zhan et al., 2006; 詹 祥江, 2006）: 扩增Y染色体SRY基因的ZX1引物，产物片段大小210bp： ZX1-F：5’- CTACATAGCCCCAACCCCTTTTC -3’ ZX1-R：5’- GGTTCTGGCCGCTGTCTCTACTAT -3’ 扩增X染色体ZFX基因的引物，产物片段大小130bp，用于区分扩增失败与鉴定为雌性的情况： ZFX-F：5’- ATAATCACATGGAGAGCCACAAGCT -3’ ZFX-R：5’- CTCCTTTTTCCTTATGCACC -3’ 4.3 微卫星标记 在进行圈养大熊猫和野生大熊猫微卫星相关工作时（包括个体识别、亲子鉴定、种群遗传管理、种 群监测、种群遗传多样性评估、种群遗传档案等），统一推荐使用30个微卫星标记（附录A），其中1-15 号为基本标记，16-30号为备选标记，可根据工作目标选用合适数量的微卫星标记。只有当基本标记不 够用时，才使用备选标记。 5 实验流程 5.1 线粒体标记扩增 使用4.1规定的线粒体标记引物对每个DNA样品进行PCR扩增，各取PCR产物2-5μL，用浓度为1.5 % 的琼脂糖凝胶电泳来检测是否扩增成功，只有当PCR扩增成功的样品才进入后续分析。若两次提取、两 次扩增均不能成功，说明DNA质量不符合要求，应该放弃该样品的后续分析。 5.2 微卫星分型 只对线粒体标记PCR扩增成功的样品进行微卫星标记分型检测； 从1-15号微卫星标记中选用6-8个标记对样品进行个体识别； 在个体识别基础上，根据研究目标从基本标记中选用更多标记对不同个体的DNA样品进行PCR扩增和 扫描分型； 如有多份DNA样品来自同一个体，选一份或多份参加后续分析，但必须注明样品编号，不要混合使 用； 5.3 性别鉴定 使用4.2规定的性别鉴定分子标记引物对不同个体的DNA样品进行PCR性别鉴定。 6 线粒体标记 PCR 方法 6.1 引物合成 将4.1规定的大熊猫线粒体控制区PCR扩增引物序列送有关公司合成。 6.2 2 PCR 扩增体系及程序 DB51/T 2404—2017 10×PCR buffer 2.0μL MgCl2 (25mmol/L) 2 0μL dNTP (2.5mM) 1.0μL Taq polymerase (2.5U/μL) 0.2μL 引物-F （15pmol/μL） 1.0μL 引物-R（15pmol/μL） 1.0μL 模板DNA 2.0μL ddH2O 10.3μL BSA (1mg/mL) 0.5μL 合计 20μL PCR扩增程序：94℃预变性5分钟；然后在PCR扩增仪上进行40个循环。每个循环为94℃变性 50 s, 55 ℃退火45 s,72 ℃ 延伸50s；最后在72℃延伸10分钟。PCR产物在4℃中保存。PCR产物经1.2%琼脂糖凝 胶电泳检测合格后送公司测序。 7 7.1 大熊猫性别鉴定的方法 PCR 扩增引物的合成 将4.2规定的大熊猫性别鉴定PCR扩增引物序列送有关公司合成。 7.2 PCR 扩增体系及程序 10×PCR buffer 2.0 μL MgCl2 (25 mmol/L) 2 μL dNTP (2.5mM) 1.0 μL Taq polymerase (2.5U/μL) 0.2μL 引物-F （15 pmol/μL） 0.8 μL 引物-R（15 pmol/μL） 0.8μL 模板DNA 2μL ddH2O 10.4 μL BSA (1mg/mL) 0.8 μL 合计 20 μL PCR扩增程序：95℃预变性5分钟；每个循环为94℃变性 50 s, 59℃退火45 s, 72 ℃ 延伸1 min， 35个循环；最后在72 ℃延伸10 min；4℃保存。 7.3 电泳检测 当PCR扩增完成后，每个样本PCR产物均先各取5μL，用浓度为2 %的琼脂糖凝胶电泳(100 V,25 min) 检测扩增结果。 3 DB51/T 2404—2017 7.4 性别判读 当扩增锌指蛋白基因时，PCR扩增所得产物片段长度为135bp和354bp，其中长度为354bp的片段来自 X染色体，长度为135bp的片段来自Y染色体，即雌性样品扩增得到一个354bp的片段，而雄性样品扩增得 到135bp和354bp两个片段。因此，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，出现两条带的是雄性，出现一条带 的是雌性。 当同时扩增锌指蛋白基因和SRY 基因时，PCR扩增所得产物片段长度为130bp和210bp，其中长度为 130bp的片段来自X染色体，长度为210bp的片段来自Y染色体，即雌性样品扩增得到一个130bp的片段， 而雄性样品扩增得到130bp和210bp两个片段。因此，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，出现两条带的是 雄性，出现一条带的是雌性。 8 微卫星标记使用方法 8.1 PCR 引物的设计、合成与荧光标记 推荐使用的30个微卫星标记的PCR引物序列设计参见附录A，将序列送有关公司合成，详细记录引物 合成的生物公司名称，合成的批次及每个引物标记的颜色，方便后续做系统误差校正。 8.2 PCR 扩增的反应体系和扩增程序 10×PCR buffer 2.0 μL MgCl2 (25mmol/L) 2.0 μL dNTP (2.5mM) 1.0 μL Taq polymerase (2.5U/μL) 0.2μL 引物-F （15 pmol/μL） 0.5μL 引物-R（15pmol/μL） 0.5μL 模板DNA 2.0μL ddH2O