ICS 65.120 B 25 备案号：56301-2017 吉 林 DB22 省 地 方 标 准 DB 22/T 2688.1—2017 饲料中三种致病菌检测 微滴数字 PCR 法 第 1 部分：沙门氏菌 Determination of three pathogenic bacteria in feed by droplet digital PCR method Part 1：Salmonella 2017 - 09 - 30 发布 吉林省质量技术监督局 2017 - 11 - 30 实施 发 布 DB22/T 2688.1—2017 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009 和GB/T 20001.4-2015 给出的规则起草。 DB22/T 2688《饲料中三种致病菌检测微滴数字PCR法》分为3个部分： ——第 1 部分：沙门氏菌； ——第 2 部分：单核细胞增生李斯特氏菌； ——第 3 部分：产气荚膜梭菌。 本部分为 DB22/T 2688 的第 1 部分。 本部分中华人民共和国吉林出入境检验检疫局提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心。 本部分主要起草人：王准、聂丹丹、李文君、杨帆、王玮琳、李忠起、彭勃、罗雁非、刘金华、刘 韬。 I DB22/T 2688.1—2017 饲料中三种致病菌检测 微滴数字 PCR 法 第 1 部分：沙门氏菌 警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问 题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。 1 范围 本标准规定了饲料中沙门氏菌检测微滴数字PCR法的试剂和材料、仪器和设备、样品、试验步骤和 试验数据处理。 本标准适用于饲料中沙门氏菌检测的微滴数字PCR法。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4789.1 食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则 GB 4789.4-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料 采样 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 WS/T 230-2002 临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用 3 原理 微滴式数字PCR平台通过产生微小油包水体系实现反应体系的分割。经PCR扩增后，根据泊松分布原 理及阳性微滴的个数与比例得出靶分子的起始拷贝数或浓度。本标准通针特异性引物和探针进行数字 PCR扩增，从而对饲料中沙门氏菌进行快速检测。 4 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水符合GB/T 6682中二级水的要求。 4.1 菌株：沙门氏菌阳性标准菌株 4.2 2 × dd PCR 预混液。 4.3 缓冲蛋白胨水（BPW）见 GB 4789.4-2016 中 3.1。 4.4 裂解液：2%CTAB(cetyltrithylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)， 100 mmol/L Tris(tris hydroxymethyl aminomethane，三羟甲基氨基甲烷)，1.4 mol/L NaCl， 20 mmol/L EDTA(ethylene diaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸)，用 HCl 调至 pH 8.0。 4.5 酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v/v）。 1 DB22/T 2688.1—2017 4.6 氯仿。 4.7 异戊醇。 4.8 无水乙醇。 4.9 异丙醇。 4.10 70％乙醇。 4.11 引物和探针 上有引物-5＇-GCGGCGTTGGAGAGTGATA-3＇ 下游引物-5＇-AGCAATGGAAAAAGCAGGATG-3＇ 探针-5＇-FAM-CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCT-TAMRA-3＇ 5 仪器和设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 6 天平：感量 0.01 g。 恒温水浴锅：46℃±1℃。 微量移液器：10μL、100μL、200μL、1 000μL。 离心机：离心转速≥12 000 r/min。 涡旋振荡器。 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 微滴生成仪。 PCR 仪。 微滴读数系统。 湿热高压蒸汽灭菌器。 样品 按照GB/T 14699.1对饲料进行采样（6.1），沙门氏菌样品的增菌培养（6.2）按照GB 4789.4进行。 7 试验步骤 7.1 样品 DNA 提取 吸取沙门氏菌增菌液1 mL（6.3），加到1.5 mL无菌离心管中，12 000 r/min离心（6.4）10 min， 吸弃上清；加入50 μL DNA提取液（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取），混匀（6.5）后沸水浴5 min，12 000 r/min离心5 min。取上清保存于 - 20 ℃备用以待检测。 也可使用商业化的DNA提取试剂盒并按照其说明制备模板DNA。 7.2 DNA 浓度和纯度的测定 取适量DNA溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计（6.6）测260 nm和280 nm处的吸收值，从而确定DNA浓度最优浓度范围，以便PCR扩增。 7.3 微滴数字 PCR 反应体系 表1 2 微滴数字 PCR 反应体系 DB22/T 2688.1—2017 试剂成分 体积 µL 2 × ddPCR 预混液 10 上游引物（10 µmol/L） 1 下游引物(10 µmol/L） 1 探针(10 µmol/L） 1 模板DNA（1~100ng/μL） 4 双蒸水 3 注1：空白对照实验时，用双蒸水替代样品DNA。 注2：阴性对照实验时，用非目标源性成分替代样品DNA。 注3：阳性对照实验时，用沙门氏菌阳性成分DNA。 7.4 微滴生成 利用微滴生成仪完成20 µL反应体系的分割（6.7）。 7.5 PCR 反应 反应条件：95℃/5 min，1个循环；95℃/15 s，60℃/1 min，40个循环；98℃/10 min（1℃/ s）， 12℃保存反应产物。体系完成后，进行数字PCR反应。荧光分析步骤采用FAM单荧光通道。 7.6 微滴读数 数字PCR反应的有效分割体系数不得低于理论分割体系数的50 %。 8 试验数据处理 8.1 阈值的设定 根据数字PCR体系中阴性分割体系的终点荧光值设定荧光的阈值限。阈值限需要对空白和阳性扩增 结果进行明显的区分。 8.2 8.2.1 8.2.2 8.2.3 8.2.4 8.3 质控标准 阳性对照：阳性基因有明显扩增，扩增终点荧光信号大于或等于阈值。 阴性对照：基因无扩增，扩增终点荧光信号小于阈值。 空白对照：基因无扩增，扩增终点荧光信号小于阈值。 与以上实验结果不符，需要重复验证实验步骤。 结果判定与报告 8.3.1 样品基因没有得到扩增，扩增终点荧光信号小于阈值，可判定样品结果为阴性，可报告未检出 沙门氏菌基因。 8.3.2 样品基因得到扩增，扩增终点荧光信号大于或等于阈值，可判定该样品结果为阳性，报告检出 沙门氏菌基因。 9 防止污染措施 3 DB22/T 2688.1—2017 按照GB 19489和WS/T 230-2002中6的规定执行。 _________________________________ 4