65.020.40 ICS B 65 DB41 河 南 省 地 方 标 准 DB41/T 1376—2017 泡桐丛枝病植原体保存体系建立规范 2017-04-24 发布 河南省质量技术监督局 2017-07-24 实施 发 布 DB41/T 1376—2017 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 泡桐丛枝病植原体培养 .............................................................. 2 5 泡桐丛枝病苗植原体鉴定 ............................................................ 3 6 泡桐丛枝病植原体保存 .............................................................. 3 7 档案管理 .......................................................................... 4 I DB41/T 1376—2017 前 言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标准由河南省林业厅提出并归口。 本标准起草单位：河南农业大学、河南省林业科学研究院。 本标准主要起草人：范国强、翟晓巧、赵振利、邓敏捷、董焱鹏、曹喜兵、李永生。 本标准参加起草人：王燕军、张变莉、孙晓薇、马向阳、马永亮、赵利新、牛苏燕、刘玟杉、 魏振峰、杨国强。 II DB41/T 1376—2017 泡桐丛枝病植原体保存体系建立规范 1 范围 本标准规定了泡桐丛枝病植原体保存体系建立的术语和定义、泡桐丛枝病植原体培养、鉴定、 保存和档案管理。 本标准适用于泡桐丛枝病植原体保存体系的建立。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 2306-2013 花卉种苗组培快繁技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 泡桐丛枝病 由于植原体侵染引起，造成泡桐的枝、叶、干、花、根部均表现畸形。隐芽大量萌发，侧枝丛 生，纤细，呈扫帚状。叶小，黄化，有时皱缩。花瓣变叶状，花柄或柱头生出小枝，花萼变薄，花 托多裂，花蕾变形，幼苗病后矮化。 3.2 泡桐丛枝病植原体 引起泡桐发生丛枝病的一类无细胞壁的原核微生物，存在于病枝、叶韧皮部筛管中，可穿过筛 板扩散和侵蚀细胞壁，在细胞内呈现球形、长杆形、椭圆形、梭形等多种形态，大小为200 nm～820 nm。 3.3 植物组织培养 在无菌条件下，将离体的植物器官（如根、茎、叶、花、果实、种子等）、组织（如形成层、 胚乳、皮层等）、细胞（体细胞和生殖细胞）或原生质体等，在配制的培养基上进行培养，在人工 控制适宜的光照和温度条件下，使之生长、分化并发育成完整植株的培养技术。 3.4 外植体 植物组织培养中作为离体培养材料的植物活体，包括完整植株、胚胎或从植物体上切取的器官、 组织等材料。 3.5 植物激素 1 DB41/T 1376—2017 是植物自身代谢产生的一类有机物质，并自产生部位移动到作用部位，在极低浓度下表现出显 著生理效应的微量物质，也被称为植物内源激素。 3.6 植物生长调节物质 人工合成的对植物的生长发育有调节作用的化学物质，与植物激素具有相似生理和生物学效 应。 3.7 培养基 在植物组织培养过程中，由人工配制的提供培养材料生长所必需的营养元素和某些植物生长物 质的基质。组成成分有水、氮源、无机盐（包括微量元素）、碳源、植物生长调节物质等。 3.8 芽诱导 将培养材料在一定的诱导培养基中进行培养，培养材料分化出不定芽的过程。 3.9 生根培养 把不定芽转移到生根诱导培养基中诱导生根，形成完整植株的过程。 3.10 繁殖系数 一个培养周期内不定芽增殖倍数，即培养一个周期后增殖的不定芽数/接种时的不定芽数。 3.11 巢式PCR 一种变异的聚合酶链反应（PCR），通过两轮PCR反应，使用两套引物扩增特异性的DNA片断。 第二对引物的功能是特异性的扩增位于首轮PCR产物内的一段DNA片断，巢式PCR的扩增具有很强的 特异性。 4 泡桐丛枝病植原体培养 4.1 泡桐丛枝病无菌苗培养 取患有丛枝病泡桐的当年生幼嫩丛枝，用质量分数为0.1%的HgCl2消毒5 min，再用无菌水清洗 5次后接种于不含任何植物激素的PC基本培养基上，培养基中蔗糖浓度20 g·L-1，琼脂浓度6 g·L-1， 培养温度25 ℃±2 ℃，光照强度130 μmoL·m-2·s-1，光照时间16 h·d-1。40 d 可获得2～3对叶片的 泡桐丛枝病无菌苗。 4.2 芽诱导 将4.1中获得的泡桐丛枝病无菌苗叶片剪成面积约0.5 cm×1 cm的小块外植体，分别接种在附 加不同浓度0.1 mg·L-1NAA～1.5 mg·L-1NAA和3 mg·L-16-BA～12 mg·L-16-BA的MS培养基上，培养基中蔗 糖质量浓度为25 g·L-1，琼脂4 g·L-1。按照4.1规定的培养条件培养20d即可出芽。 4.3 根诱导 当诱导出的芽长到约3 cm时，从茎基部剪下，分别放入附加不同浓度0 mg·L-1NAA～0.5 mg·L-1NAA 的1/2 MS（大量元素减半的MS培养基）生根培养基上，培养基中蔗糖质量浓度为25 g·L-1，琼脂4.5 g·L-1。按照4.1规定的培养条件下生根培养。培养20d，可形成完整根系的初代培养苗。 2 DB41/T 1376—2017 5 泡桐丛枝病苗植原体鉴定 5.1 泡桐丛枝病苗 DNA 提取 将初代培养苗顶芽剪下，用蒸馏水清洗干净后，再用滤纸吸干材料上的水分，经液氮速冻后， 保存到-80 ℃冰箱中，用于DNA提取。 泡桐基因组DNA的提取采用离心柱型植物基因组DNA提取试剂盒，提取步骤参照植物基因组DNA 提取说明书，并将提取泡桐基因组DNA溶于100 μL TE中，-20 ℃保存备用。 5.2 泡桐丛枝病植原体巢式 PCR 检测 泡桐丛枝病植原体的鉴定采用巢式PCR检测。PCR扩增的基本条件：PCR总反应体系25 µL， 其 中包括2.5 µL 10×Taq 酶缓冲液（Tris-HCl，25 mmol·L-1 MgCl2，50 mmol·L-1 KCl，0.1% Triton X-100， pH 9.0），2.5 µL dNTP（10 mmol·L-1），20 ng患病泡桐模板DNA，植原体16 S rRNA通用引物Primer1 （10 µmol·L-1）和Primer 2（10 µmol·L-1） 各0.5 µL（Primer1：5’-ACGACTGCTAAGACT-GG-3’；Primer2： 5’-GCGGTGTGTACAAACCCCCG-3）；1.25 U Taq DNA聚合酶。反应体系在PTC-200基因扩增仪上进行。 扩增程序为94 ℃预变性3 min；再94 ℃变性1 min，52 ℃退火1.5 min，72 ℃延伸2 min，共30 个循环；最后72 ℃延伸10 min。 泡桐丛枝病植原体16S rRNA检测采用Nest-PCR进行2轮扩增，两轮引物序列分别是R16mF1：5′CAT GCA AGT CGA ACG GA-3′，R16mR1：5′- CTT AAC CCC AAT CAT CGA-3′；R16F2：5′-ACG ACT GCT AAG ACT GG-3′，R16R2：5′-GCG GTG TGT ACA AAC CCC G-3′。第一轮扩增反应体系为25 µL，10× Taq 酶 缓冲液2.5 µL, 模板DNA 20 ng，0.5 µL R16mF1（10 µmol·L-1），0.5 µL R16mR1（10 µmol·L-1）， 2.5µL dNTP（10 µmol·L-1），0.25 µL Taq DNA聚合酶（5 U/µL），第二轮PCR体系同第一轮，1 µL 模板DNA（第一轮PCR产物稀释50倍），0.5 µL引物R16mF2（10 µmol·L-1），0.5 µL引物R16mR2（10 µmol·L-1），其他成分同第一轮，反应程序如下： 94 ℃预变性3 min；再94 ℃变性1 min；52 ℃ 退火1 min；72 ℃延伸2 min，扩增5次循环；94 ℃变性30 s；52 ℃退火1 min；72 ℃延伸2 min； 扩增25次循环；最后72 ℃再延伸10 min；4 ℃ 保存。待第二轮PCR程序结束后，取第二轮扩增产 物2.5 µL，在1%琼脂糖凝胶（含0.5% EB）上80 V电泳1 h，观察电泳结果。如检测出植原体16S rRNA 特有的1.2 Kb条带即可证明所取的材料含有泡桐丛枝病植原体。 6 泡桐丛枝病植原体保存 6.1 泡桐丛枝病植原体苗继代培养 当初代培养苗的芽生长至3 cm时，从茎基部剪下，放入附加不同植物生长调节物质的1/2MS培 养基上进行继代培养，培养基中蔗糖质量浓度为25 g·L-1，琼脂4.5 g·L-1。在4.3培养条件下生根， 培养20d时，可形成完整的根系。经培养获得的苗木为第二代，根据需要可依此方法多次继代培养， 泡桐丛枝病植原体可长期保存。 6.2 继代培养泡桐丛枝病植原体的鉴定 鉴定方法按5.2规定。 7 档案管理 3 DB41/T 1376—2017 建立泡桐丛枝病植原体培养体系档案，内容包括：材料来源、培养过程记载资料、实物材料及 图片资料。档案应由专人负责填写和保管，并由业务领导和技术人员审查签字，长期保存。 _________________________________ 4