ICS 65.020.30 B 43 备案号：56304-2017 吉 林 DB22 省 地 方 标 准 DB 22/T 2691—2017 明胶中貉源性成分定性检测 实时荧光 PCR 法 Identification of Raccoon Dog derived materials in gelatin - Real time PCR method 2017 - 09 - 30 发布 吉林省质量技术监督局 2017 - 11 - 30 实施 发 布 DB22/T 2691—2017 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2015给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国吉林出入境检验检疫局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心，中华人民共和国吉林 市出入境检验检疫局，虎林出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：刘金华，王岸英，刘婧，聂丹丹，罗雁非，王玮琳，曲辉，吴鑫本。 I DB22/ 2691—2017 明胶中貉源性成分定性检测 实时荧光 PCR 法 警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问 题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。 1 范围 本标准规定了明胶中貉源性成分实时荧光PCR检测方法的试剂和材料、仪器和设备、样品、试验步 骤、试验数据处理。 本标准适用于明胶中貉源性成分的实时荧光PCR检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 6783 食品安全国家标准 食品添加剂 明胶 GB/T 14699.1 饲料 采样 GB/T 25165 明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法 实时荧光PCR法 3 原理 利用实时荧光PCR技术，根据貉物种的特异性基因序列对貉源性成分进行鉴定。利用裂解液破碎细 胞，用酚、三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA；以提取的DNA为模板进行内参照基因的实时荧光 PCR检测，以确定样品DNA的提取效率；通过特异性引物和标记荧光物质的探针进行貉源性成分的实时荧 光PCR扩增，根据对PCR扩增反应中荧光信号生成扩增曲线的判定，实现对貉源性成分的定性分析。 4 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水符合GB/T6682中二级水的要求。 4.1 裂解液: 2%CTAB(cetyltrithylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)；100 mmol/L Tris(tris hydroxymethyl aminomethane，三羟甲基氨基甲烷)；1.4 mol/L NaCl；20 mmol/L EDTA(ethylene diaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸)，用 HCl 调至 pH8.0。 4.2 2×Real-time PCR 预混液。 4.3 酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v/v）。 4.4 氯仿。 4.5 异戊醇。 4.6 无水乙醇。 1 DB22/ 2691—2017 4.7 4.8 4.9 异丙醇。 70%乙醇。 哺乳动物特异基因（内参基因）引物和探针 哺乳动物特异基因上游引物：5’-AGTGCTTAGTTGAATTAGGCCATG-3’ 哺乳动物特异基因下游引物：5’-TCCAGTATGCTTACCTTGTTACGA-3’ 哺乳动物特异基因探针：5’-（FAM）-CGCACACACCGCCCGTCACCC-（TAMRA）-3’ 4.10 貉特异基因用引物及探针 貉特异基因上游引物：5’- CTATACCTGGCATCTGGTTCTTACC-3’ 貉特异基因下游引物：5’- GTCCCATTTGAGTGGATTAGTAGGA-3’ 貉特异基因探针：5’-（FAM)-CAGGGCCATGAACTCCCTCCATCC-(TAMRA) -3’ 5 仪器和设备 5.1 实时荧光 PCR 仪。 5.2 高速冷冻离心机(不少于 12 000 r/min)。 5.3 涡旋混合器。 5.4 分析天平：感量 0.01 g。 5.5 微量移液器：0.1 μL～2.5 μL，1μL～10 μL，2 μL～20 μL，10 μL～100 μL，20 μL～200 μL， 100 μL～1000 μL。 5.6 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 5.7 恒温水浴箱或金属浴。 6 样品 按照GB 6783对食用明胶采样（5.4），按照GB/T 14699.1对饲料明胶采样，将实验样品粉碎，充分 混匀后待用。 7 试验步骤 7.1 样品 DNA 提取 按GB/T 25165规定的方法对样品进行DNA提取（5.2,5.3,5.5,5.6,5.7）。 7.2 实时荧光 PCR 扩增 7.2.1 进行样品检测时，应同时对内参基因及貉特异基因进行扩增，并设立阴性对照、空白对照和阳 性对照实验（5.1）。 7.2.2 实时荧光 PCR 反应条件随仪器不同略有改变，一般为： 95 ℃/10 min ，1 个循环；95 ℃/15 s ， 60 ℃/1 min ，45 个循环，在每次循环的 60 ℃/1 min 时收集荧光。 7.2.3 检测结束后，根据扩增曲线和 Ct 值判定结果。样品设 2 个重复，以 Ct 平均值作为最终结果。 7.2.4 实时荧光 PCR 反应体系见表 1。 表1 2 实时荧光 PCR 反应体系 DB22/ 2691—2017 体积 试剂成分 8 µL 2×Real-time PCR预混液 10 上游引物（10 µmol/L） 1 下游引物(10 µmol/L） 1 探针(10 µmol/L） 1 模板DNA（1 ng/μL ~100 ng/μL） 5 双蒸水 2 试验数据处理 8.1 8.1.1 8.1.2 8.1.3 8.1.4 8.1.5 8.2 PCR 有效性判定 空白对照为无 FAM 荧光信号，相应 Ct 值>40。 阴性对照为无 FAM 荧光信号，相应 Ct 值>40。 阳性对照有 FAM 荧光信号，且 FAM 通道出现明显的扩增曲线，Ct 值≤36。 内参照基因检测 Ct 值应在 20～35 之间。 否则判定为 PCR 无效。 试验结果 8.2.1 待测样品貉源性基因检测 Ct 值大于或等于 40，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者， 则可判定该样品未检出貉源性成分。 8.2.2 待测样品貉源性基因检测 Ct 值小于 36，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判 定该样品检出貉源性成分。 8.2.3 待测样品貉源性基因检测 Ct 值在 36～40 之间，应重做实时荧光 PCR 扩增。再次扩增后的结果 Ct 值仍小于 40 者，且阴性对照和阳性对照结果正常，则可判定该样品检出貉源性成分；再次扩增后结 果 Ct 值大于 40，且阴性对照和阳性对照结果正常，可判定该样品未检出貉源性成分。 _________________________________ 3