ICS 65.020.01 B 61 DB13 河 北 省 地 方 标 准 DB13/T 2596—2017 苹果组培苗繁育技术规程 2017 - 11 - 22 发布 河北省质量技术监督局 2017 - 12 - 22 实施 发 布 DB13/T 2596—2017 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由河北农业大学提出。 本标准起草单位：河北农业大学。 本标准主要起草人：师校欣、杜国强、高仪、杨丽丽、许建锋、王燕霞、张莹、刘婉君、成晓华。 I DB13/T 2596—2017 苹果组培苗繁育技术规程 1 范围 本标准规定了苹果品种和砧木（Malus spp.）组织培养繁育过程中的术语和定义、苹果组培苗生 产设施、培养基制备、组培室消毒灭菌、苹果组培苗生产、组培苗质量标准、包装、标签和运输等方 面的操作规程。 本标准适用于苹果品种和砧木组织培养繁育苗木。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 9847 苹果苗木 LY/T 1882-2010 林木组织培养育苗技术规程 NY/T 1085-2006 苹果苗木繁育技术规程 NY/T 2306-2013 花卉种苗组培快繁技术规程 NY/T 2719-2015 苹果苗木脱毒技术规范 3 术语和定义 LY/T 1882-2010、NY/T 2306-2013等界定的以及下列术语和定义适用于本文件。为便于使用，以 下重复列出了LY/T 1882-2010、NY/T 2306-2013中的某些术语和定义。 3.1 植物组织培养 plant tissue culture 在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体，在人工培养基和人工控制的环境 中，使其再生新植株的过程和技术。 [LY/T 1882-2010，定义3.2] 3.2 茎尖培养 meristem culture 以植物茎尖为外植体，通过组织培养的方式获得完整植株的一种生物技术。一般用来进行脱毒种 苗的生产，以获得不含检疫及影响植物正常生长的病毒的植株。 [NY/T 2306-2013，定义3.4] 3.3 培养基 medium 根据植物营养原理和植物组织培养的要求，人工配制的营养基质。 [LY/T 1882-2010，定义3.4] 1 DB13/T 2596—2017 3.4 培养基母液 medium stock solution 按试剂种类和性质分别配制的高于培养基配方浓度的溶液。 [LY/T 1882-2010，定义3.5] 3.5 灭菌 sterilization 通过物理、化学及一些理化方法，杀灭一切微生物（包括孢子等）的过程。 [NY/T 2306-2013，定义3.5] 3.6 消毒 disinfection 通过物理、化学方法去除物体表面大部分有害病原微生物（孢子除外）的过程。 [NY/T 2306-2013，定义3.10] 3.7 外植体 explant 从自然生长的活体植物上获取的用于建立植物组培快繁体系的起始材料。 [NY/T 2306-2013，定义3.8] 3.8 接种 inoculation 在无菌条件下将消毒后的外植体或继代、生根组培材料接入培养基的过程。 注：改写NY/T 2306-2013，定义3.3。 3.9 初代培养 explant culture 采集外植体并对其进行消毒接种，将其置于适宜的培养条件下，启动生长、获得最初的无菌培养 材料的过程。 3.10 继代培养 subculture 外植体经初代培养后，再次以及以后各次接种于新培养基继续培养的过程。 [LY/T 1882-2010，定义3.7] 3.11 丛梢 shoot clump 在适宜条件下，外植体的顶芽或腋芽萌发形成的嫩梢会长出新的腋芽，腋芽又不断萌发出嫩梢， 此过程重复发生而形成的多芽多梢的集合体。 2 DB13/T 2596—2017 3.12 试管苗 plantlet in vitro 通过组织培养方法获得的培养容器中的培养材料。包括外植体初代培养、继代培养、生根培养各 阶段的组培材料。 注：改写NY/T 2306-2013，定义3.7。 3.13 组培苗 plant propagated via tissue culture 利用植物组织、器官或细胞等作为起始材料，通过植物组织培养方式生产获得的植株。 [NY/T 2306-2013，定义3.12] 4 苹果组培苗生产设施 苹果组培苗繁育实验室或组培生产工厂应包括培养基制备室、洗涤室、灭菌室、接种室、培养室、 制水室、储存室（仓库）、温室或大棚等部分，面积可视工作（生产）规模确定。 5 培养基制备 5.1 培养基配方 5.1.1 基本培养基采用 MS 培养基或 C17 培养基，具体成分分别见附录 A 中的表 A.1 和附录 B 中的表 B.1。 5.1.2 外植体初代培养基 新红星等元帅系品种：C17 + 6-苄基腺嘌呤（6-BA）0.5 mg/L + 吲哚丁酸（IBA）0.2 mg/L + 水 解酪蛋白（CH）300 mg/L + 蔗糖30 g/L + 固化剂（能使培养基凝固的最低用量，视固化剂种类确定）。 除元帅系外的其它苹果品种和砧木：MS + 6-BA 0.5 mg/L ～1.0 mg/L + 萘乙酸（NAA）0.05 mg/L + 蔗糖35 g/L + 固化剂（能使培养基凝固的最低用量，视固化剂种类确定）。 5.1.3 继代培养基：基本培养基 MS（C17）+ 6-BA1.0 mg/L ～3.0 mg/L + NAA0.05 mg/L + 蔗糖 35 g/L + 固化剂（同 5.1.2）。 5.1.4 生根培养基：1/2MS（1/2C17）+ IBA 0.3 mg/L~0.6 mg/L + 吲哚乙酸（IAA）1.0 mg/L + 蔗 糖 25 g/L + 固化剂（同 5.1.2）。 5.1.5 不同苹果品种或砧木组织培养时， 培养基中生长调节物质的浓度可根据以上配方给出的浓度范 围适当调整。 5.1.6 为降低成本，蔗糖可用等量食用白砂糖代替。 5.2 母液配制 5.2.1 母液配制选用化学纯以上纯度的化学试剂，使用蒸馏水或去离子水。 3 DB13/T 2596—2017 5.2.2 根据附录 A 中表 A.1 和附录 B 中表 B.1 的基本培养基配方成分分组和浓度扩大倍数，分别配制 大量元素（50 倍）母液、钙元素（50 倍）母液、微量元素-1（200 倍）母液、微量元素-2（500 倍） 母液、铁元素（100 倍）母液和有机物（100 倍）母液。 5.2.3 植物生长调节物质配制成单一成分母液，浓度以方便使用为原则，一般为 0.1 mg/ml～0.5 mg/ml。 5.2.4 培养基母液试剂瓶分别贴上标签，标注母液名称、配制倍数和日期，置于冰箱冷藏保存。有机 物母液、铁元素母液和植物生长调节物质母液应储存在棕色试剂瓶中。 5.3 培养基配制程序 5.3.1 根据培养基配方与培养基配制数量， 计算各种母液的用量及配方中其它成分的用量， 登记在册， 以备查证。 5.3.2 按照计算结果称量固化剂与蔗糖（或白砂糖），加入已温热的蒸馏水中，蒸馏水的量以培养基 配制体积的 1/2～2/3 为宜，不断搅拌，熬至沸腾。 5.3.3 在熬开的锅内加入相应母液，加蒸馏水定容，充分搅拌均匀。 5.3.4 用 1.0 mol/L 盐酸或 1.0 mol/L 氢氧化钠调节 pH 值至 5.8～6.0。 5.3.5 将培养基分装到培养容器中，用封口膜、封口盖或棉塞加牛皮纸封口。 5.3.6 将培养基放入高压蒸汽灭菌器内灭菌。灭菌温度 121℃，灭菌时间 20 min。 5.3.7 灭菌后的培养基在干净、阴凉的室内常温平放保存，保存时间不宜超过 2 周。 6 组培室消毒灭菌工作细则 组培室保持清洁卫生，消毒灭菌工作细则参见附录C。 7 苹果组培苗生产 7.1 无菌接种操作 7.1.1 利用超净工作台提供的无菌环境进行接种，使用超净工作台接种前应提前 20 min 开机及紫外 灯。接种前关闭紫外灯，用 75 %的酒精擦拭工作台台面及玻璃内壁。 7.1.2 用于切分外植体或无菌组培材料的培养皿、不锈钢小盘等需事先高压灭菌。 7.1.3 刀、镊子等接种工具用酒精擦拭或浸泡，再用电热接种工具灭菌器（280℃～320℃）或酒精灯 灼烧灭菌后，置搁置台上冷却至常温使用。 7.2 外植体初代培养 7.2.1 外植体采集及处理 7.2.1.1 选择品种纯正或砧木类型一致、性状稳定、生长健壮、无病虫危害和机械损伤的植株。 4 DB13/T 2596—2017 7.2.1.2 在春季采集由叶芽萌发长出几片小幼叶的幼嫩新梢、未木质化或半木质化新梢，去除新梢上 展开的叶片，未展开的小幼叶可不去除。亦可选用一年生枝，将基部浸于水中室内催芽，待叶芽萌动 长出幼嫩新梢后及时采集。 7.2.1.3 将外植体表面用自来水冲洗干净，较长新梢剪段，置于瓶中。 7.2.2 外植体消毒 7.2.2.1 按照 7.1 的要求准备好超净工作台及接种工具。 7.2.2.2 使用 5 %次氯酸钠溶液，消毒时间 10 min～15 min；使用 0.1 %氯化汞溶液，消毒时间 6 min ～ 15 min。消毒时间可根据材料的幼嫩程度、洁净程度适当调整。 7.2.2.3 消毒期间多次晃动消毒容器，以保证外植体与消毒剂充分接触。 7.2.2.4 外植体消毒完成后，用无菌水冲洗 4 遍以上。 7.2.2.5 使用过的氯化汞废液禁止随意倾倒，应妥善收集保存，交由当地环保部门处理。 7.2.3 外植体切分接种 7.2.3.1 长度 1 cm 以下的幼嫩新梢去掉外围叶片，基部切出新鲜切口，接入培养基；较长的新梢切 单节茎段，节位密集时，亦可切双节或多节茎段接种。 7.2.3.2 每瓶接 1 个～3 个外植体，要求分布均匀，深浅适中。 7.2.3.3 封好瓶口后，注明品种代号、接种人员、接种日期等，放至培养室培养。 7.2.3.4 外植体出现褐化时要频繁多次转接，减轻毒害。 7.2.3.5 元帅系品种初代培养较难，可在接种后常规培养 1 周，然后暗培养 1 周，再常规培养。暗培 养可将材料置于培养室中的暗培养橱，或在培养架用黑布遮盖。 7.2.3.6 利用茎尖培养脱除病毒培育无病毒原种和无病毒苗时，应剥取 0.1 mm～0.2 mm 的茎尖分生 组织（带 1 个或 2 个叶原基）作为外植体接种。 7.3 继代与增殖培养 7.3.1 将初代或继代培养材料，去除基部愈伤组织、老化组织及生长