ICS 11.220 B 41 DB13 河 北 省 地 方 标 准 DB 13/T 2650—2018 奶牛结核病防治技术规范 2018 - 03 - 13 发布 河北省质量技术监督局 2018 - 04 - 13 实施 发 布 DB13/T 2650—2018 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由唐山市质量技术监督局提出。 本标准起草单位：唐山市动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：张 军、路广计、刘志勇、张子佳、刘乃强、李 颖、陶茂辉、周忠良、张 晓利、姜得英、王爱军、李玉文、冒银祥、周建颖、董长兴、齐 彪、张 芳。 I DB13/T 2650—2018 奶牛结核病防治技术规范 1 范围 本标准规定了奶牛结核病的诊断、检测、预防、控制等。 本标准适用于奶牛结核病防治，其他牛参照执行。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 18645-2002 动物结核病诊断技术 GB/T 27639 结核病病原菌实时荧光 PCR 检测方法 NY/T 1169 畜禽场环境污染控制技术规范 NY/T 1567 标准化奶牛场建设规范 NY 5047 无公害食品 奶牛饲养兽医防疫准则 农医发〔2017〕25 号 《病死及病害动物无害化处理技术规范》 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 奶牛结核病污染场 指奶牛结核病阳性检出率在1 %以上或有临床病例的奶牛养殖场。 3.2 奶牛结核病控制场 指连续2年以上奶牛结核病个体阳性检出率在1 %以下，所有阳性牛均已扑杀，且无临床病例发生 的奶牛养殖场。 3.3 奶牛结核病稳定控制场 指连续2年以上奶牛结核病个体阳性检出率在0.2 %以下，所有阳性牛均已扑杀，且无临床病例发 生的奶牛养殖场。 3.4 奶牛结核病净化场 1 DB13/T 2650—2018 指连续2年以上未检出奶牛结核病阳性病例，且无临床病例发生的奶牛养殖场。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AvPPD：禽型结核菌素； BPPD：牛型结核菌素； PPD：提纯蛋白衍生物，提纯结核菌素； PCR：聚合酶链式反应； PBS：磷酸盐缓冲液； Elisa：酶联免疫吸附试验。 5 诊断 5.1 流行特点 结核病奶牛最易感染，其次为黄牛、牦牛。结核病病牛是本病的主要传染源。牛型结核分枝杆菌 随鼻汁、痰液、粪便和乳汁等排出体外，健康牛可通过被污染的空气、饲料、饮水等经呼吸道、消化 道等途径感染。 5.2 临床症状 潜伏期一般为10 d～45 d，有的可长达数月或数年，以肺结核、乳房结核和肠结核最为常见,主要 症状如下： a) 肺结核：以长期顽固性干咳为特征，且以清晨最为明显。患畜容易疲劳，逐渐消瘦，病情严 重者可见呼吸困难。 b) 乳房结核：一般先是乳房淋巴结肿大，继而后方乳腺区发生局限性或弥漫性硬结，硬结无热 无痛，表面凹凸不平。泌乳量下降，乳汁变稀，严重时乳腺萎缩，泌乳停止。 c) 肠结核：消瘦，持续下痢与便秘交替出现，粪便常带血或脓汁。 5.3 剖检变化 在肺脏、乳房和胃肠粘膜等处形成特异性白色或黄白色结节。结节大小不一，切面干酪样坏死或 钙化，有时坏死组织溶解和软化，排出后形成空洞。胸膜和肺膜可发生密集的结核结节，形如珍珠状。 5.4 实验室诊断 5.4.1 诊断方法 5.4.1.1 细菌学检查 按GB/T 18645-2002第3章规定执行。 5.4.1.2 结核分枝杆菌 PPD 皮内变态反应试验 按GB/T 18645-2002第4章规定执行。 5.4.1.3 实时荧光 PCR 检测 2 DB13/T 2650—2018 按GB/T 27639规定执行。 5.4.1.4 牛结核病 γ-干扰素 Elisa 试验 按附录A进行。 5.4.2 结果判定 5.4.2.1 临床判定 根据5.1、5.2和5.3做出初步判定。 5.4.2.2 实验室判定 5.4中任一诊断方法结果为阳性的判为奶牛结核病阳性。 5.5 检测 5.5.1 检测比例 5.5.1.1 净化场按发现疫病的抽样方式确定检测比例。 5.5.1.2 稳定控制场、控制场、污染场 100 %检测。 5.5.2 检测频率 5.5.2.1 奶牛结核病净化场和稳定控制场，每年至少监测一次。 5.5.2.2 奶牛结核病控制场每年至少监测二次，间隔至少 5 个月以上。 5.5.2.3 奶牛结核病污染场每季度监测一次。 5.5.2.4 初生犊牛应于 20 日龄时进行第一次监测。 6 预防 6.1 防疫条件 6.1.1 奶牛场建设、布局等按 NY /T 1567 执行。 6.1.2 奶牛场环境控制按 NY/T 1169 执行。 6.1.3 奶牛饲养、兽医防疫按 NY 5047 执行。 6.2 生物安全 6.2.1 奶牛繁育使用的精液、胚胎来源于结核病净化种群，附有官方出具的检测阴性证明。 6.2.2 场内禁止屠宰或解剖牛只；粪便、污水及其他污物及时清理并进行无害化处理。 6.2.3 定期杀灭吸血昆虫和鼠类等啮齿动物。 6.2.4 限制外来车辆、人员入场，必需进入时应经消毒，但禁止进入生产区。 6.2.5 禁止人畜混居，不得混养其他畜禽，并防止周围其他畜禽进入。 3 DB13/T 2650—2018 6.3 人员要求 直接从事奶牛场工作的人员应取得卫生部门发放的健康证明。 7 控制 7.1 疫情报告 任何单位和个人发现疑似病牛，应当及时向当地兽医主管部门、动物卫生监督机构或者动物疫病 预防控制机构报告。 7.2 阳性牛处理 按《病死及病害动物无害化处理技术规范》规定执行。 4 DB13/T 2650—2018 附 录 A （规范性附录） 牛结核病γ-干扰素 Elisa 试验 A.1 试验材料 A.1.1 牛结核分枝杆菌 γ -干扰素检测试剂盒； A.1.2 肝素钠真空采血管； A.1.3 牛型提纯结核菌素（PPD）和禽型提纯结核菌素（PPD）； A.1.4 常用化学试剂：95%乙醇、88%磷酸； A.1.5 仪器设备：酶标仪、洗板机、微量移液器、低温离心机、培养箱、微量振荡器。 A.2 试验方法 A.2.1 全血采集及培养 A.2.1.1 采血 无菌采集至少5ml血液放入肝素抗凝管中，轻轻颠倒几次混合血液，使肝素溶解。室温（22℃±5℃， 避免温度过高或过低）下运送到实验室并在采血后24h内进行培养。避免血液冷冻和冷藏。 A.2.1.2 血液分装 分装应在无菌条件下进行操作。分装前轻轻颠倒试管，充分混匀血液样品。由于本试验需要活的 淋巴细胞，因此需要将细胞损伤降至最低。将抗凝血加入24孔组织培养板，每头动物加三管1.5mL分装 的抗凝血,见表A.1。 表 A.1 吸取血液或抗原至 24 孔培养板的推荐操作 试剂 动物编号 1 号动物 bPPD 1 AvPPD 1 PBS 1 2 号动物 bPPD 2 AvPPD 2 PBS 2 3 号动物 bPPD 3 AvPPD 3 PBS 3 4 号动物 bPPD 4 AvPPD 4 PBS 4 5 号动物 bPPD 5 AvPPD 5 PBS 5 6 号动物 bPPD 6 AvPPD 6 PBS 6 7 号动物 bPPD 7 AvPPD 7 PBS 7 8 号动物 bPPD 8 AvPPD 8 PBS 8 A.2.1.3 加入刺激抗原 5 DB13/T 2650—2018 在无菌条件下，加入100µL PBS、bPPD和 AvPPD至相应的孔。抗原必须与分装的血液充分混匀， 最好用一个微量振荡器高速振荡1min。如无合适的仪器，将细胞培养板及其盖紧紧固定在一起，在光 滑的表面上顺时针和逆时针各旋转10次。小心操作不要引起交叉污染，也不要让血液附在盖上。避免 血液起泡。只有刺激抗原与血液完全混合，试验才能达到最佳效果。 A.2.1.4 孵育 将含有血液和抗原的组织培养板在37℃湿温培养箱中孵育16h～24h。 A.2.1.5 血浆样品的收获 用可调移液器小心吸取约400µL的上层血浆，转入独立的1.5mL离心管中。吸取血浆时应尽量避免 吸入细胞。污染极少量红细胞不会影响γ-干扰素酶免疫试验。 A.2.1.6 血浆的贮存 血浆可在2℃～8℃贮存7天，在-20℃可贮存几个月。贮存前，每个贮存管应用合适的盖子密封。 在样品架上标记日期、操作者的首字母、管内容物、动物编号和牛群细节等相关信息。检测前，样品 应恢复至室温并充分混匀。 A.2.2 检测 A.2.2.1 试剂准备 A.2.2.1.1 ELISA 板 未开封前，在室温平衡至少1h。 A.2.2.1.2 阴阳性对照 用无菌蒸馏水或去离子水溶解，确保完全溶解，溶解后的阴阳性对照可在2℃～8°C保存3个月。使 用前恢复至室温，并充分混匀。 A.2.2.1.3 洗液 使用前恢复至室温，用蒸馏水或去离子水 20 倍稀释。 A.2.2.1.4 稀释液 直接使用，使用前恢复至室温，主要用于稀释酶标结合物。 A.2.2.1.5 结合物 用稀释液 50 倍稀释，现用现配，适量配制。见表 A.2。 表 A.2 结合物和稀释液体积 ELISA 板 结合物体积 稀释液体积 1 200µl 9.8ml 2 400µl 19.6ml 3 600µl 29.4ml 4 800µl 39.2ml 5 1000µl 49ml A.2.2.1.6 TMB 6 DB13/T 2650—2018 直接使用，使用前恢复至室温。 A.2.2.1.7 终止液 直接使用，使用前恢复至室温。 A.2.2.2 注意事项 A.2.2.2.1 实验前除结合物外，其它试剂与试验样品必须恢复至室温。 A.2.2.2.2 试剂盒所有试剂需 2℃～8℃保存，用完后应立即放回 2℃～8℃保存。 A.2.2.2.3 用无菌蒸馏水或去离子水充分溶解冻干物质，溶解后平衡至少 15min，使用前混匀。 A.2.2.2.4 待检上清应先加到稀释板，然后用 8 道或 12 道的移液器转到 ELISA 板上，保证加入的上 清孵育时间一致。 A.2.2.2.5 阴性和阳性 γ -干扰素对照品和空白对照每次应加入到固定孔中，在第 H 行的 10，11 和 12 孔。 A.2.2.2.6 每个板条应做好标记，并适当固定板条，以防板条从板框中脱落，或防止脱落后板条顺序 混乱不清，对检测造成不必要的麻烦。 A.2.2.2.7 未用完的板条应放入含干燥剂的自封袋中 2℃～8℃保存。如保存得当可保存至有效期止。 不可混用不