ICS 65.020 B 05 吉 DB22 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2801—2017 食药用菌菌种检验鉴定技术规范 Technical inspection of inspection appraisal of edible and medicinal mushroom 2017 - 12 - 11 发布 吉林省质量技术监督局 2018 - 04 - 01 实施 发 布 DB22/T 2801—2017 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由吉林省农业委员会提出并归口。 本标准起草单位:吉林农业科技学院、敦化市北方食用菌研究所、蛟河市黄松甸镇吉蕈食用菌研究 所、吉林市汇丰科技有限公司。 本标准主要起草人:唐玉琴、赵义涛、徐济责、宫敬利、赵本利、原忠礼、于汇。 I DB22/T 2801—2017 食药用菌菌种检验鉴定技术规范 1 范围 本标准规定了食药用菌菌种的菌种样品、检验鉴定方法及菌种质量判定。 本标准适用于担子菌类食药用菌各级固体菌种的质量检验鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 12728-2006 食用菌术语 GB 19169 黑木耳菌种 GB 19170 香菇菌种 GB 19171 双孢蘑菇菌种 GB 19172 平菇菌种 NY/T 528-2010 食用菌菌种生产技术规程 NY 862 杏鲍菇和白灵菇菌种 NY/T 1097 食用菌菌种真实性鉴定 酯酶同工酶电泳法 NY/T 1284 食用菌菌种中杂菌及害虫的检验 NY/T 1730 食用菌菌种真实性鉴定 ISSR法 NY/T 1731 食用菌菌种良好作业规范 NY/T 1742-2009 食用菌菌种通用技术要求 NY/T 1743 食用菌菌种真实性鉴定 RAPD法 NY/T 1845 食用菌菌种区别性鉴定 拮抗反应 NY/T 1846 食用菌菌种检验规程 3 术语和定义 GB/T 12728-2006界定的以及下列术语和定义适用于本文件。为了便于使用以下重复列出了GB/T 12728-2006中的一些术语和定义。 3.1 菌种 culture 生长在适宜基质上具结实性的菌丝培养物，包括母种、原种和栽培种。 [GB/T 12728-2006，定义 2.5.6] 3.2 母种 stock culture 经各种方法选育得到的具有结实性的菌丝体纯培养物及其继代培养物。也称一级种、试管种。 [GB/T 12728-2006，定义 2.5.7] 1 DB22/T 2801—2017 3.3 原种 mother spawn 由母种移植、扩大培养而成的菌丝体纯培养物。也称二级菌种。 [GB/T 12728-2006，定义 2.5.8] 3.4 栽培种 calture spawn 由原种移植、扩大培养而成的菌丝体纯培养物。栽培种只能用于栽培，不可再次扩大繁殖菌种。也 称三级种。 [GB/T 12728-2006，定义 2.5.9] 3.5 锁状联合 clamp connection 多数担子菌的双核菌丝在进行细胞分裂时在细胞隔处会形成一个锁臂状突起。 3.6 分生孢子 conidium 真菌无性孢子的一种，由单核菌丝或双核菌丝顶端或旁侧分别形成的薄壁细胞。通常着生于分生孢 子梗上。 3.7 木腐菌 wood rotting mushroom 生长在木本植物上可引起木材腐烂的食药用菌。 3.8 草腐菌 straw rotting mushroom 生长在草本植物残体上的食药用菌。 3.9 菌龄 period of spawn running 接种后菌丝在适宜营养及环境条件下生长发育的时间。 3.10 拮抗现象 antagonism 具有不同遗传基因的菌落间互相抑制产生不生长区带或形成不同形式线形边缘的现象。 [GB/T 12728-2006，定义 2.3.21] 4 菌种样品 4.1 要求 4.1.1 4.1.2 4.2 样品应在适宜条件下保藏。 样品应具有真实性和代表性。 取样方法 4.2.1 菌种生产方样品 4.2.1.1 母种 应按被检样品的品种、培养条件、接种时间分批编号，按批次随机抽取并留样。 4.2.1.2 2 原种和栽培种 DB22/T 2801—2017 应按被检样品的来源、制种方法、接种时间分批编号，按批次随机抽取并留样。 4.2.2 菌种使用方样品 应在适宜菌种保藏条件和保藏期内，对购置菌种进行取样。 4.3 数量 4.3.1 母种 被检样品为每批次菌种量的5%，每批次取样数量不得少于10 支，超过100 支的可对所抽取样品二 次取样。 4.3.2 原种 被检样品为每批次菌种量的2%，每批次取样数量不得少于10 瓶（袋），超过100 瓶（袋）的可对 所抽取样品二次取样。 4.3.3 栽培种 被检样品为每批次菌种量的1%，每批次取样数量不得少于10 瓶（袋），超过100 瓶（袋）的可对 所抽取样品二次取样。 5 检验鉴定方法 5.1 感官检验 5.1.1 适用范围 该方法用于菌种纯度、活力、病虫害的检验。 5.1.2 5.1.2.1 方法 母种 采用下列所有方式进行检验: ——容器:用以毫米为单位的刻度尺测量试管外径以及长度，肉眼观察试管有无破损; ——封口塞:在无菌条件下，手触以及肉眼观察是否干燥、洁净，以手提起以及拔出封口塞的状况 检查松紧度，以塞入试管口内三分之二或露出试管口外三分之一的塞长检查封口塞的滤菌性; ——斜面长度:用以毫米为单位的刻度尺测量斜面长度是否达试管长度的二分之一至三分之二，斜 面顶端距至封口塞的距离是否为 40 mm～50 mm; ——斜面外观:肉眼观察培养基边缘是否与试管壁分离以及培养基的颜色; ——菌落状态:肉眼观察斜面上菌丝体颜色以及疏密程度; ——纯度:按下列步骤进行:  杂菌:分两步进行观察:  肉眼观察:用放大镜观察斜面培养物表面有无光滑、湿润的细菌菌落，有无与正常菌 丝不同颜色的霉菌菌丝以及分生孢子，封口塞上有无粉状的霉菌孢子，拔出棉塞后鼻 嗅试管内是否有异味。  培养观察:用接种耙切取 5 mm×5 mm 大小的菌丝培养物，接种于附录 A.1 或 A.2 的 平板（按附录 A.3 制备平板）上，于 25 ℃～28 ℃ 培养 7 d～10 d 取出后肉眼观察。 3 DB22/T 2801—2017  5.1.2.2 检查平板上有无绿、黑、黄、红、灰白等颜色的霉菌孢子。打开培养皿盖鼻嗅是否有 异味。 害虫:食药用菌菌种的害虫及螨类，应按 NY/T 1284 的规定检验。 原种和栽培种 采用下列所有方式进行检验: ——容器:用以毫米为单位的刻度尺测量菌种瓶（袋）外径及菌种瓶（袋）内菌料的高度，肉眼观 察有无破损; ——封口物:手触以及肉眼观察是否干燥、洁净; ——菌落状态和菌龄:肉眼观察菌料内菌丝体颜色、菌料颜色及菌丝疏密程度，木屑菌料可以手触 测试弹性，手捏菌料测试湿润以及碎散程度; ——纯度  杂菌  用放大镜观察菌料表面有无光滑、湿润的细菌菌落;封口物、瓶颈交界处、接种口处 或菌料表面有无与正常菌丝不同颜色的霉菌菌丝以及霉菌孢子。  用接种镊子取 3 mm×3 mm～5 mm×5 mm 大小的菌料，接种于附录 A.1 或 A.2 的平板 （按附录 A.3 制备平板）上，于 28 ℃ 培养 1 d～2 d，肉眼观察菌落外观色泽以及 边沿整齐情况，接种块周围菌丝是否均匀、有无粘稠的细菌菌落;培养 7 d～10 d 后 取出肉眼观察菌落外观颜色，有无绿、黑、黄、红、灰白等颜色的霉菌菌丝以及霉菌 孢子。  用接种镊子取 3 mm×3 mm～5 mm×5 mm 大小的菌料，接种于附录 B 营养肉汤培养基 中，28 ℃ 摇床培养 1 d～2 d，肉眼观察液体培养基是否为半透明、浑浊等状态， 同时鼻嗅培养液是否有异味。  害虫:食药用菌菌种的害虫及螨类，应按 NY/T 1284 规定检验。 5.2 显微检验 5.2.1 适用范围 该方法用于菌种真实性以及活力的检验。 5.2.2 方法 5.2.2.1 水浸片法 挑取被检样品中少量菌丝于载玻片的水滴中，用解剖针疏散菌丝，盖上盖片，先用10 倍物镜观察 菌丝是否粗壮、丰满、均匀，再用40 倍物镜观察菌丝有无锁状联合。如需测量菌丝粗细，则应按照NY/T 1846规定的方法执行。该法用于初筛检验。 5.2.2.2 插片法 挑取被检样品中少量菌丝接种于2 个附录A.1或A.2 的平板（按附录A.3制备平板）上，25 ℃ 培养 3 d，在菌落边缘处插入无菌盖玻片继续培养，待菌丝长至盖玻片的三分之一时，取出进行DAPI染色后 在荧光显微镜下观察菌丝粗细、细胞核数量，有无锁状联合。如需测量菌丝粗细，则应按NY/T 1846规 定的方法执行。 5.3 4 生长速度测定 DB22/T 2801—2017 5.3.1 适用范围 该方法用于菌丝长满平板培养基以及长满瓶装或袋装培养料所需天数的检验。 5.3.2 方法 5.3.2.1 母种 用接种耙切取5 mm×5 mm大小的被检样品菌丝培养物，接种于5 个附录A.1或A.2的平板（按附录A.3 制备平板）上，于25 ℃～28 ℃ 培养7 d～11 d，3 d后开始观察，以后每天观察并记录菌丝长满平板 天数。 5.3.2.2 原种和栽培种 适用符合NY/T 528-2010中4.7.1.3、4.7.1.4 规定的食药用菌原种、栽培种的菌种瓶（袋），根据 不同菌类选择附录C中适宜的培养基，装10 瓶（袋）灭菌冷却后按要求接入被检验菌种，适温条件下恒 温培养5 d后开始观察，以后每隔3 d观察一次，记录菌丝长满瓶（袋）天数。 5.4 农艺性状检验 5.4.1 适用范围 该方法用于菌种抗性、产量、质量、一致性以及稳定性的检验。 5.4.2 方法 5.4.2.1 制作原种 以被检样品母种作为种源，木腐菌选择附录C.1、C.2或C.4中适宜的原种培养基配方，草腐菌选择 附录C.3中适宜的原种培养基配方，制备原种15 瓶（袋），然后分成3 组，应按NY/T 528-2010和NY/T 1731 进行规范的制种管理。以法定认可的标准菌株或留样菌种为对照菌种。 5.4.2.2 栽培 5.4.2.2.1 木腐菌 根据被检样品菌类，选择附录C.1、C.2或C.4中适宜的木腐菌栽培种配方，制备45 个栽培袋，然后 分成3 组，分别按GB 19169、GB