ICS 67.050 Z 50 福 DB35 建 省 地 方 标 准 DB35/T 1657—2017 养殖水体中丁香酚的测定 气相 色谱-质谱法 Determination of Eugenol in aquaculture water by Gas Chromatography Mass Spectrometry 2017 - 05 - 05 发布 福建省质量技术监督局 2017 - 08 - 05 实施 发 布 DB35/T 1657—2017 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则编写。 本标准由福建省海洋与渔业厅提出并归口。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准起草单位：福建省水产研究所、福建省渔业环境监测站、农业部渔业产品质量监督检验测试 中心（厦门）。 本标准主要起草人：刘海新、罗冬莲、余颖、姜琳琳、位绍红、王丽娟、叶玫、罗方方。 I DB35/T 1657—2017 养殖水体中丁香酚的测定 气相色谱-质谱法 1 范围 本标准规定了养殖水体中丁香酚含量测定的气相色谱-质谱法。 本标准适用于养殖水体中丁香酚含量的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 用正己烷萃取水样中丁香酚，萃取液经无水硫酸钠脱水、减压浓缩后，硅胶固相萃取柱净化，气相 色谱-质谱检测，内标法定量。 4 试剂和材料 以下所用的试剂，除特殊注明外均为分析纯试剂；水为符合GB/T 6682-2008规定的一级水。 4.1 丁香酚标准品：纯度≥99 %。 4.2 甲基丁香酚标准品：纯度≥99 %。 4.3 正己烷：色谱纯。 4.4 乙酸乙酯：色谱纯。 4.5 无水硫酸钠：经 650 ℃灼烧 4 h，冷却后干燥器中贮存备用。 4.6 氯化钠：经 650 ℃灼烧 4 h，冷却后干燥器中贮存备用。 4.7 硅胶固相萃取柱：2 g/6 mL，或性能相当者。 4.8 标准储备液：称取丁香酚（4.1）10.0 mg（精确至 0.1 mg）于 100 mL 棕色容量瓶中，乙酸乙酯 （4.4）溶解并稀释至刻度，配制成 100 μg/mL 的溶液备用，8 ℃以下冷藏避光保存，有效期 3 个月。 4.9 内标储备液：称取甲基丁香酚（4.2）10.0 mg（精确至 0.1 mg）于 100 mL 棕色容量瓶中，乙酸 乙酯（4.4）溶解并稀释至刻度，配制成 100 μg/mL 的溶液备用，8 ℃以下冷藏避光保存，有效期 3 个月。 4.10 标准中间液：移取 100 μg/mL 标准储备液（4.8）1.00 mL 于 10 mL 棕色容量瓶中，用乙酸乙酯 （4.4）稀释至刻度，配制成 10.0 μg/mL 的溶液备用，8 ℃以下冷藏避光保存，有效期 15 天。 4.11 内标中间液：移取 100 μg/mL 内标准储备液（4.9）1.00 mL 于 10 mL 棕色容量瓶中，用乙酸乙 酯（4.4）稀释至刻度，配制成 10.0 μg/mL 的溶液备用，8 ℃以下冷藏避光保存，有效期 15 天。 4.12 内标使用液：移取 10.0 μg/mL 内标中间液（4.11）0.40 mL 于 10 mL 棕色容量瓶中，用乙酸乙 酯（4.4）稀释至刻度，配制成 0.40 μg/mL 的溶液，使用时现配现用。 1 DB35/T 1657—2017 4.13 标准工作液：准确移取适量 10.0 μg/mL 丁香酚标准中间液（4.10）和 10.0 μg/mL 内标中间液 （4.11），用乙酸乙酯（4.4）稀释成 5.00、10.0、50.0、100、150、500、1000 μg /L 的标准工作液， 内标物浓度均为 100 μg/L，使用时现配现用。 5 仪器与设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 5.11 5.12 6 气相色谱-四极杆质谱联用仪（GC-MS）：配备电子轰击电离源（EI）。 分析天平：感量 0.1 mg 和 0.01 g。 旋涡混合器。 旋转蒸发仪。 氮吹仪。 水相尼龙滤膜：0.45 μm。 有机相针式过滤器：0.22 μm。 固相萃取装置。 三角瓶：100 mL。 鸡心瓶：100 mL。 分液漏斗：100 mL。 玻璃刻度试管。 样品的采集与保存 现场采集的200 mL水样装入小口棕色玻璃瓶中，盖紧、标明标记，冷藏避光运输，8 ℃以下冷藏避 光保存，7 天内检测。 7 样品测定 7.1 样品萃取 水样经滤膜（5.6）抽滤。移取过滤后的水样20.0 mL于三角瓶（5.9）中，加入氯化钠（4.6）1.5 g～ 2 g，振荡溶解。将水样转入100 mL的分液漏斗中，加入20 mL的正己烷（4.3），剧烈振荡2 min后静置 5 min，收集上层有机相于另一个三角瓶（5.9）中。用15 mL的正己烷（4.3）重复提取一次，合并两次 萃取有机相。加入4 g～5 g的无水硫酸钠（4.5），旋涡振荡10 s后，转入100 mL的鸡心瓶（5.10）中。 用5 mL的正己烷（4.3）洗涤无水硫酸钠，合并正己烷于鸡心瓶(5.10)中。于37 ℃减压浓缩至8 mL～10 mL，用于固相萃取。 7.2 固相萃取净化 硅胶固相萃取柱（4.7）预先用3 mL正己烷（4.3）活化，上样，控制流速约为每秒1滴，弃去流出 液。4 mL正己烷（4.3）淋洗，乙酸乙酯（4.4）8 mL洗脱，收集洗脱液于玻璃刻度试管（5.12）中，40 ℃氮吹至1.5 mL，加入0.40 μg/mL内标使用液（4.12）0.50 mL，乙酸乙酯（4.4）定容到2 mL，混匀， 有机相针式过滤器（5.7）过滤，供气相色谱-质谱仪测定。 7.3 7.3.1 2 仪器参考条件 色谱条件 DB35/T 1657—2017 7.3.1.1 石英毛细管柱：14 %氰丙基苯基（其中 7 %氰丙基 7 %苯基）86 %二甲基聚硅氧烷，30 m×0.25 mm×0.25 μm。 7.3.1.2 进样口温度：250 ℃。 7.3.1.3 进样方式：不分流进样。 7.3.1.4 进样量：1 μL。 7.3.1.5 色谱柱升温程序：初始温度为 80 ℃，保持 2 min；10 ℃/min 升温至 185 ℃；20 ℃/min 升 温至 250 ℃保持 4 min。 7.3.1.6 载气：氦气（纯度>99.999%），流速：1.0 mL/min。 7.3.2 质谱参数 7.3.2.1 电离模式：电子轰击电离源（EI），能量为 70 eV。 7.3.2.2 离子源温度：250 ℃，传输线温度：250 ℃，溶剂延迟 10 min。 7.3.2.3 离子检测方式：选择离子检测（SIM），丁香酚检测离子为：103、131、149、164，定量离子 164；甲基丁香酚检测离子：103、147、163、178，定量离子 178。 7.4 样品的定性测定和定量测定 7.4.1 定性测定 7.4.1.1 为保证分析的选择性和灵敏度要求，丁香酚和甲基丁香酚的色谱峰应基线分离，同时采用不 同时间窗口检测丁香酚和甲基丁香酚特征离子。 7.4.1.2 在相同测试条件下，样液中丁香酚色谱保留时间和内标物保留时间的比值，即相对保留时间， 应与标准工作液中丁香酚的相对保留时间偏差在±0.5%以内，且目标物中检测到定性离子的相对丰度， 与浓度相当的标准工作液中定性离子相对丰度进行比较，若偏差不超过表 1 规定的范围，则可认为试样 中存在对应的待测物。 表1 7.4.2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度（%） 允许偏差（%） >50 ±10 20～50（不含 20） ±15 10～20（不含 10） ±20 ≤10 ±50 定量测定 采用内标法单离子定量，选定浓度与样液相近的标准工作液，以峰面积比计算。标准工作溶液和样 液中的丁香酚和甲基丁香酚响应值均应在仪器线性范围内。上述仪器条件下，丁香酚和甲基丁香酚的选 择离子流图见附录A。 7.5 空白实验 除不加试样外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。 8 结果计算 试样中丁香酚残留量按下式计算，计算结果均需扣除空白值： 3 DB35/T 1657—2017 X  A  Cs  V  B As  B  V m s .............................. (1) 式中： X —— 试样中丁香酚含量，μg/L； A —— 样液中丁香酚的峰面积； Cs —— 标准工作液中丁香酚的浓度，μg /L； Bs —— 标准工作液中甲基丁香酚的峰面积； B —— 样液中甲基丁香酚的峰面积； As —— 标准工作液中丁香酚的峰面积； Vm —— 试样体积，mL； V —— 试样定容体积，mL。 注：测定结果用平行测定后的算术平均值表示，保留三位有效数字。 9 9.1 方法灵敏度、准确度和精密度 灵敏度 本方法的检测限为0.5 μg/L，定量限为1 μg/L。 9.2 准确度 本方法在添加浓度1 μg/L～50.0 μg/L时，回收率为70 %～120 %。 9.3 精密度 本方法的相对标准偏差≤15 %。 A 4 DB35/T 1657—2017 BB 附 录 A （资料性附录） 丁香酚和甲基丁香酚选择离子流图 A.1 丁香酚标准溶液及加标空白水样选择离子流图 丁香酚标准溶液选择离子流图见图A.1。 RT: 9.00 - 12.00 NL: 4.88E4 m/z= 163.50-164.50 F: + c SIM ms [102.50-103.50, 130.50-131.50, 148.50-149.50, 163.50-164.50] MS ICIS data08 RT: 11.18 AH: 48191 100 90 Relative Abundance 80 70 丁香酚 60 50 40 30 20 10 NL: 1.49E5 m/z= 177.50-178.50 F: + c SIM ms [102.50-103.50, 146.50-147.50, 162.50-163.50, 177.50-178.50] MS ICIS data08 RT: 11.38 AH: 148625 100 90 80 70 甲基丁香酚 60