ICS 65.020.40 B 60 辽 DB21 宁 省 地 方 标 准 DB21/T 3153—2019 桤叶唐棣组培育苗技术规程 Technical regulation on tissue culture and seedling breeding for Amelanchier alnifolia Nutt. 2019 - 05 - 30 发布 辽宁省市场监督管理局 2019 - 06 - 30 实施 发 布 I 目 前 次 言 ................................................................................ III 桤叶唐棣组培育苗技术规程 .................................................................. 1 1 范围 ..................................................................................... 1 2 规范性引用文件 ........................................................................... 1 3 术语和定义 ............................................................................... 1 4 生产设备及化学试剂 ....................................................................... 2 5 生产环境及设备的消毒灭菌 ................................................................. 3 6 培养基制作 ............................................................................... 4 7 外植体处理方法 ........................................................................... 5 8 组织培养 ................................................................................. 5 9 定植 ..................................................................................... 8 附录 A ..................................................................................... 9 （资料性附录） ............................................................................ 9 桤叶唐棣形态特征和生物学特性 .............................................................. 9 附录 B .................................................................................... 10 （资料性附录） ........................................................................... 10 B.1 MS 培养基母液的配制表 ................................................................. 10 附录 C .................................................................................... 11 （规范性附录） ........................................................................... 11 表 C.1 常用植物生长调节物质配制表 ......................................................... 11 前 言 本标准依据GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准的附录 A、附录 B、附录 C 均为资料性附录。 本标准由辽宁省林业和草原局提出并归口。 本标准起草单位：辽宁省农林旱地研究所。 本标准主要起草人：黄立华、王占龙、朱虹、龙忠伟、郑璐、尚福强、赵兴秋、蔡静、鹿天阁、孟春 雷、于欣、王艳辉、王鹏、王玉峰、金亚荣、王春丽、王孝军、董立军、刘杰、李在芬、王玉峰、步 兆东。 Ⅱ DB21/T 3153—2019 桤叶唐棣组培育苗技术规程 1 范围 本标准规定了桤叶唐棣（Amelanchier alnifolia Nutt.)组培育苗技术的术语和定义、生产设备及化 学试剂、生产环境及设备的消毒灭菌、培养基制作、外植体处理方法、组织培养程序、定植等技术要求。 本标准适用于辽宁省桤叶唐棣组培快繁育苗。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 1882 林木组织培养育苗技术规程 GB 4285 农药安全使用标准 GB/T 8321 农药合理使用准则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 桤叶唐棣 Saskatoon berry 蔷薇科（Rosaceae）唐棣属落叶灌木或小乔木。原产于北美洲从美国阿拉斯加州至横穿加拿大西部的 大部分地区以及美国中西部和中北部地区，其生长地势从北部的海平面一直到加利福尼亚州海拔 2600m甚 至落基山脉海拔3400m的高度。桤叶唐棣较喜光，尤其是果实成熟期需要大量的阳光，同时具有抗寒、耐旱、 对气候和土壤适应性强的特点，能适应大多数土壤类型如栗钙土、黑钙土、褐色土和棕壤等。原生地气候 条件为亚寒带和温带大陆性干旱、半干旱气候，年均气温-3.2℃～9.4℃，无霜期 80～120d，能适应冬季 -40℃严寒。 3.2 无菌培养体系的建立（初代培养）Establishment of aseptic culture system 将灭过菌的外植体接种于培养基上，诱导出愈伤组织或芽的培养过程。 3.3 生根培养 Take root culture 1 DB21/T 3153—2019 将继代培养产生的无根芽苗接种到生根培养基中，经诱导生根得到完整的试管植株的过程。 3.4 试管苗 seedling in vitro 培养在培养瓶中无污染的，具有根、茎、叶的完整植株。 3.5 炼苗 Acclimatization 将试管苗移至日光温室或大棚进行强光锻炼。 3.6 移栽 transplanting 在设施育苗情况下，将试管苗从培养瓶内移到瓶外，采取降温、控水等措施进行逐步锻炼的过程，使 其定植后能适应露地的不良环境条件。 3.7 褐化 brown 外植体在离体培养过程中，培养物从伤口处分泌褐色物质进而导致自身长势不佳甚至死亡的现象。 3.8 玻璃化 vitrification 在组织培养过程中，试管苗生长异常，叶、嫩梢呈水晶透明或半透明、水浸状；整株矮小肿胀、失绿； 叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎。 3.9 增殖系数 proliferation coefficient 外植体再生形成的芽的平均数。 3.10 定植 planting 将移栽成活后的试管苗移到圃地的过程。 4 生产设备及化学试剂 4.1 组培场地选择 组培实验室必须选择安静、清洁、无污染的地方。 4.2 接种设备 超净工作台、解剖刀、镊子、酒精灯、医用小推车、广口瓶、白瓷碟、无菌滤纸。 2 DB21/T 3153—2019 4.3 灭菌设备 高压蒸汽灭菌锅、紫外线灯、烘干箱 4.4 灭菌药剂及辅助剂 75%酒精、90% 酒精、0.1%升汞、高锰酸钾、甲醛、84 消毒液、洗衣粉、洗涤灵等。 4.5 培养基及植物生长调节剂 MS 培养基、6-苄氨基嘌呤、奈乙酸、吲哚丁酸、白糖、琼脂等。 4.6 培养设备 300ml 培养瓶、培养架、空调、照明灯管。 4.7 试验设备 冰箱、电子天平、（0.01mg、0.001mg）、磁力搅拌器、酸度计、照度计、温湿度表、移液枪、移液管、 试剂瓶、容量瓶、烧杯等。 5 生产环境及设备的消毒灭菌 5.1 培养瓶清洗与消毒 将使用过的培养瓶或盛培养基的玻璃器皿中污物如培养基、培养物倒掉，再浸入水中，然后洗涤。有 微生物污染的器皿，必须先进行高压消毒和煮沸，杀死菌体后进入水中洗涤。器皿洗净后，烘干或晾干， 放在规定的地方，以待取用。 5.2 接种器械灭菌 5.2.1 高压蒸汽灭菌 使用前接种器械、器皿及定性滤纸用牛皮纸包裹后再用聚丙烯薄膜裹紧、包扎。将分装好的培养基和 接种用具放入高压锅的消毒桶内，锅内灭菌物不超过锅容量的3/4为宜，高压灭菌时锅内使用蒸馏水。打开 电源加热，压力保持在0.105 MPa～0.12MPa（注意压力不要超过0.14MPa），时间为30min。 5.2.2 灼烧灭菌 在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入250ml～ 500ml的装有75%酒精的广口瓶中，使用之前取 出在酒精灯外焰处灼烧灭菌，冷却后，立即使用。每次重新操作都要把工具在火焰上消毒。 5.3 紫外线灭菌 转接操作前，在接种室、超净工作台用紫外线灯照射25min～30min。 5.4 准备室消毒 每天用84消毒液稀释至1000倍或75%酒精喷洒洗涤准备室地面，保持室内清洁。 5.5 接种室及培养室消毒灭菌 3 DB21/T 3153—2019 房间关闭紧密，将甲醛置于广口容器中，加高锰酸钾氧化挥发，熏蒸2d～3d,通风无味后2d～3d人员方 可进入。接种室每30d用高锰酸及甲醛混合熏蒸，培养室每60d用高锰酸及甲醛混合熏蒸。工作期间每3d用 75%酒精喷雾消毒。 5.6 无菌操作 (a)进入无菌室前，洗手，去掉指甲中的污物。 (b)入室时换上经过消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。 工作人员操作前用 75%的酒精擦洗双手，操 作中需经常用