ICS 65.020 B 15 云 南 省 地 方 标 准 DB53/T 944—2019 甘蔗抗褐锈病基因 Bru1 的 PCR 检测技术规程 2019 - 09 - 23 发布 云南省市场监督管理局 2019 - 12 - 23 实施 发 布 DB53/T 944—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1－2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由云南省农业科学院甘蔗研究所提出。 本标准由云南省农业标准化技术委员会（YNTC07）归口。 本标准起草单位：云南省农业科学院甘蔗研究所。 本标准主要起草人：王晓燕、李文凤、黄应昆、张荣跃、单红丽、仓晓燕、李婕、罗志明、尹炯。 I DB53/T 944—2019 甘蔗抗褐锈病基因 Bru1 的 PCR 检测技术规程 1 范围 本标准规定了甘蔗抗褐锈病基因Bru1 PCR检测方法的原理、设备和器具、引物和试剂、操作步骤 及结果判定等。 本标准适用于甘蔗属及其杂交种抗褐锈病基因Bru1的PCR检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文本。 2.1 甘蔗褐锈病 是指由黑顶柄锈菌（Puccinia melanocephala H. Sydow & P. Sydow）侵染引起的甘蔗病害。 2.2 Bru1 Bru1 是在甘蔗栽培品种‘R570’上发现和定位的第 1 个甘蔗抗褐锈病主效基因，被定位于甘蔗 第 7 条染色体的 0.42 cM 区域内，该基因对褐锈病菌具有广谱抗性。 3 原理 根据甘蔗抗褐锈病基因Bru1序列设计区域特异性引物，提取不同甘蔗品种/材料的总DNA，对试样 进行PCR扩增，依据是否扩增获得预期大小的DNA及酶切片段来判断样品是否携带该抗病基因。 4 4 4.1 设备和器具 设备 电子天平（感量 0.01 g～0.0001 g）、涡旋混匀器、恒温水浴锅、台式离心机、PCR扩增仪、微波 炉、电泳槽、电泳仪、凝胶成像仪、-20 ℃冰箱、可调微量移液器。 4.2 器具 移液枪头、离心管、PCR管等，所有器具使用前需经高压蒸汽121 ℃灭菌30 min。 5 引物和试剂 5.1 基本要求 所有试剂均为分析纯，水为灭菌去离子水。 1 DB53/T 944—2019 5.2 PCR 引物 PCR 引物为： a) R12H16 标 记 ： 上 游 引 物 为 5′-CTACGATGAAACTACACCCTTGTC-3′ ， 下 游 引 物 为 5′-CTTATGTTAGCGTGACCTATGGTC-3′，预期扩增产物长度为570 bp。 b) 9O20-F4 标 记 ： 上 游 引 物 为 5′-TACATAATTTTAGTGGCACTCA GC-3′ ， 下 游 引 物 为 5′-ACCATAATTCAATTCTGCAGGTAC-3′，扩增产物经Rsa I酶切后得到的预期产物长度为200 bp。 5.3 PCR 试剂 PCR试剂包括： a) 2×EasyTaq PCR SuperMix（含染料） b) 其他试剂：限制性内切酶Rsa I（10 U/µL），DNA 分子量标记。 5.4 电泳缓冲液 5.4.1 TAE 电泳缓冲液 5.4.1.1 50×TAE 存储液 取 242 g Tris 和 37.2 g Na2EDTA·2H2O，加入约 800 mL 去离子水充分搅拌溶解；加入 57.1 mL 冰 乙酸，充分溶解；用 NaOH 调节 pH 至 8.3，加去离子水定容至 1000 mL，室温保存。 5.4.1.2 1×TAE 工作液 用去离子水将50×TAE存储液稀释50倍，即为工作液。 5.4.2 TBE 电泳缓冲液 5.4.2.1 5×TBE 存储液 取 54 g Tris，3.72 g Na2EDTA·2H2O，27.5 g 硼酸，加入约 800 mL 去离子水充分搅拌溶解；用 NaOH 调节 pH 至 8.0，加去离子水定容至 1000 mL，室温保存。 5.4.2.2 0.5×TBE 工作液 用去离子水将5×TBE存储液稀释10倍，即为工作液。 5.4.3 扩增产物电泳检测试剂 琼脂糖、核酸染料。 6 对照 对照为： a) 以已知含抗褐锈病基因Bru1的甘蔗品种/材料为阳性对照。 b) 以已知未含抗褐锈病基因Bru1的甘蔗品种/材料为阴性对照。 c) 以灭菌去离子水作为空白对照。 7 操作步骤 2 DB53/T 944—2019 7.1 样品采集 取甘蔗植株充分展开的第一片新叶，放入密封袋中，于-20 ℃保存备用。 7.2 蔗叶总 DNA 的提取 蔗叶总DNA按以下方法提取： a) 取0.1 g蔗叶样品，用液氮冷冻研磨至粉状，用植物基因组DNA提取试剂盒（具体方法步骤按照 提取试剂盒说明书操作）提取蔗叶总DNA； b) 提取后用蛋白/核酸分析仪检测DNA质量，当A260/A280比值为1.8～2.0时，适合于PCR扩增。 7.3 PCR 扩增 7.3.1 R12H16 标记的 PCR 扩增 按以下方法进行PCR扩增： a) 在20 μL PCR管中按序加入灭菌去离子水9.5 μL、2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL、DNA模板2.0 μL、上游引物0.5 μL（20 μM）、下游引物0.5 μL（20 μM）,充分混匀后快速离心10 s后放进PCR仪； b) 扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，35个循环；72℃ 延伸5 min。 7.3.2 9O20-F4 标记的 PCR 扩增 按以下方法进行PCR扩增： a) 在20 μL PCR管中按序加入灭菌去离子水12.7 μL、2×EasyTaq PCR SuperMix 10.5 μL、DNA模板 1.0 μL、上游引物0.4 μL（20 μM）、下游引物0.4 μL（20 μM）,充分混匀后快速离心10 s后放进PCR仪； b) 扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，35个循环；72℃ 延伸5 min； c) 扩增结束后, 在另一个新的20 μL PCR管中按序加入灭菌去离子水6.5 μL、10×酶切Buffer 2.5 µL、 Rsa I（10 U/µL）1.0 µL、PCR产物15.0 µL，充分混匀后快速离心10 s后放进PCR仪； d) 酶切程序为：37 ℃ 2 h，65 ℃10 min。 7.3.3 琼脂糖凝胶电泳检测 按以下方法进行琼脂糖凝胶电泳： a) R12H16 标记的 PCR 产物用 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，9O20-F4 标记的 Rsa I 酶切产物用 2.0% 琼脂糖凝胶电泳检测； b) 用琼脂糖加入 1×TAE 缓冲液或 0.5×TBE 缓冲液中配制成 1.5%和 2.0%（W/V）的溶液，加热至 琼脂糖完全熔化； c) 待凝胶冷却至 50℃～60℃时，加入 0.005%的核酸染料混匀，将其倒入制胶板上，插上梳板； d) 充分冷却后，轻轻拔去梳板，放入装有 1×TAE 缓冲液或 0.5×TBE 缓冲液的电泳槽中； e) 每个样品取 10 μL PCR 产物依次加入点样孔里，在其中一个点样孔中加入 DNA 分子量标记，140 V 电压下电泳 20 min，把胶板取出后用凝胶成像仪观察、拍照。 8 结果判定 当阳性对照的R12H16和9O20-F4-Rsa I标记都出现目的条带，阴性对照和空白对照无目的条带时， 检测结果有效。当检测结果有效时，参照附录A并依据表1进行结果判定。 3 DB53/T 944—2019 表1 甘蔗抗褐锈病基因Bru1 PCR检测结果判定标准 R12H16（570 bp） 9O20-F4-Rsa I（200 bp） 阳性对照 阴性对照 空白对照 结果判定 有 有 有 无 无 含Bru1基因 有 无 有 无 无 不含Bru1基因 无 有 有 无 无 不含Bru1基因 样品 4 DB53/T 944—2019 A A 附 录 A （资料性附录） 甘蔗抗褐锈病基因 Bru1 的 PCR 检测电泳图 A.1 R12H16 标记 R12H16标记见图A.1。 图A.1 甘蔗新品种（系）抗褐锈病基因Bru1检测的R12H16标记PCR扩增电泳图 M：DNA分子量标记；1-13：甘蔗新品种（系）材料；PC：抗病对照R570；NC：感病对照选蔗3号； CK：空白对照 A.2 9O20-F4-Rsa I标记 9O20-F4-Rsa I标记见图A.2。 图A.2 甘蔗新品种（系）抗褐锈病基因Bru1检测的9O20-F4-Rsa I标记酶切电泳图 M：DNA 分子量标记；1-13：甘蔗新品种（系）材料；PC：抗病对照 R570；NC：感病对照选蔗 3 号； CK：空白对照。 _________________________________ 5 DB53/T 944－2019