ICS 65.020.20 B 05 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1648—2019 蒙桑组织培养育苗技术规程 Tissue culture technical regulation of Morus mongolica 2019-05-20 发布 内蒙古自治区市场监督管理局 2019-08-20 实施 发布 DB15/T 1648—2019 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 环境及器具灭菌 .................................................................... 1 5 培养基配制 ........................................................................ 2 6 外植体选取及灭菌 .................................................................. 3 7 初代培养 .......................................................................... 4 8 继代培养 .......................................................................... 4 9 生根培养 .......................................................................... 4 10 炼苗与培养 ....................................................................... 5 11 病虫害防治 ....................................................................... 6 附录 A（资料性附录） MS 培养基母液配制表 ............................................ 7 I DB15/T 1648—2019 前 言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标准由内蒙古自治区林业和草原局提出并归口。 本标准起草单位：内蒙古和盛生态科技研究院有限公司、内蒙古农业大学、内蒙古和盛生态育林有 限公司、北京蒙树生态环境工程有限公司。 本标准主要起草人：赵泉胜、铁英、白玉娥、彭鹏、刘洋、田菊。 II DB15/T 1648—2019 蒙桑组织培养育苗技术规程 1 范围 本标准规定了蒙桑（Morus mongolica）组织培养育苗的术语和定义、环境及器具灭菌、培养基配 制、外植体选取及灭菌、初代培养、继代培养、生根培养、炼苗与培养、病虫害防治等基本内容及技术 要求。 本标准适用于利用蒙桑组织培养技术生产苗木。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 LY/T 1882-2010 林木组织培养育苗技术规程 3 术语和定义 LY/T 1882-2010界定的术语和定义适用于本文件。 4 环境及器具灭菌 4.1 准备室消毒灭菌 经常用消毒液消毒，保持室内清洁。 4.2 接种室消毒灭菌 保持室内清洁。接种前用紫外灯照射30 min～40 min，关闭紫外灯20 min后方可进入。 4.3 培养室消毒灭菌 经常用消毒液对地面、组培架等设施进行消毒。 4.4 超净工作台消毒灭菌 接种前应用紫外灯照射30 min～40 min，打开无菌风吹40 min以上；然后用70%酒精棉擦拭台面。 定期清洗超净工作台的过滤膜，具体方法：摘下滤膜，使用流水冲洗干净，晾干，安装，紫外灯照射灭 菌。 4.5 器具消毒灭菌 1 DB15/T 1648—2019 4.5.1 接种器具消毒灭菌 接种前，将接种工具用滤纸包好，置于高压灭菌锅灭菌，要求温度121 ℃、时间30 min。使用前用 酒精灯外焰灼烧20 s以上，或用接种工具灭菌器直接灭菌。 4.5.2 污染瓶消毒灭菌 用高压灭菌锅消毒，然后再用自来水清洗培养瓶。 5 培养基配制 5.1 基本培养基选择 选择MS培养基为基本培养基。 5.2 母液配制和保存 5.2.1 母液的配制 MS培养基母液配制成几种化合物的混合母液，A液配制成20倍母液，B、C液配制成100倍母液，D液 配制成200倍母液，E液配制成50倍母液，具体参数参见附录A。 植物生长调节物质配制浓度为1.0 mg/mL。 5.2.2 母液的保存 母液配制好后，贴上标签，注明溶液名称、配制时间、配制者，置于4 ℃冰箱存放。每瓶试剂使用 前应目测无结晶、无异色才能使用。 5.3 培养基制备 5.3.1 准备 根据培养基成分准备好蒸馏水、蔗糖、琼脂和各类母液等试剂药品，烧杯、容量瓶、移液枪、量筒、 天平、药匙、磁力搅拌器、pH计等器具。 5.3.2 琼脂融化 先加蒸馏水700 mL/L左右，再加入5.5 g/L～6.0 g/L琼脂，加热搅拌使琼脂融化。 5.3.3 糖溶解 琼脂融化后，初代和生根培养基加蔗糖20 g/L，继代培养基加30 g/L蔗糖，搅拌使糖溶解。 5.3.4 加母液 配制初代和继代培养基时，用量筒取A液母液、B液母液、C液母液、D液母液、E液母液分别为50 ml/L、 10 ml/L、5 ml/L、5 ml/L、10 ml/L，混合均匀备用。 配制生根培养基时，A液母液、B液母液、C液母液、D液母液、E液母液分别为25 ml/L、10 ml/L、5 ml/L、5 ml/L、10 ml/L，混合均匀备用。 初代培养基母液混合液中添加 IBA 0.5 mg /L和 6-BA 1.0 mg /L。 增殖继代培养基母液混合液中添加 IBA 0.5 mg /L和 GA3 0.5 mg /L。 生根培养基母液混合液中添加 IBA 0.3 mg /L。 2 DB15/T 1648—2019 5.3.5 定容 搅拌均匀后，加蒸馏水定容。 5.3.6 pH 值测定和调节 充分搅拌后，用pH计测定pH值，用1 mol/L的HCl溶液或1 mol/L的NaOH溶液调节至pH 5.8～6.0。 5.3.7 分装 使用240 ml规格的培养瓶定量分装，每瓶分装约50 ml；生根使用350 ml规格的培养瓶，每瓶分装 约65 ml。 5.3.8 封口 盖紧瓶盖，或用封口膜封口。 5.3.9 灭菌 用高压灭菌锅灭菌，温度121 ℃，保持20 min～30 min。 5.3.10 冷却 灭菌后的培养基放在室内冷却，待完全凝固后使用。 5.3.11 贮存 灭菌后的培养基应注明编号。在4 ℃无菌条件下贮藏备用，贮存时间不应超过一个月。 6 外植体选取及灭菌 6.1 外植体采集 在树龄不超过20年的树冠上，选择无病虫害、生长健壮的中上部枝条，7月至次年3月，采集半木质 化枝条或一年生枝作外植体。 6.2 外植体灭菌 6.2.1 表面清洗 将采集的外植体去掉叶片，用洗洁精或洗衣粉水全面刷洗表面，剪刀剪成带2～4个芽的小段，放入 带口容器中，用一层纱布包裹容器口，自来水流水冲洗30 min，倒掉容器中自来水，在容器表面快速喷 少量75%酒精，放在超净工作台中备用。 6.2.2 酒精和升汞灭菌 处理好的茎段用75%酒精浸泡40 s，无菌水冲洗3次，再用1%升汞浸泡15 min，用无菌水漂洗至少5 次，用灭菌滤纸吸干残留水分。 6.3 外植体制备 在超净工作台内，将灭菌好茎段用灭菌后的手术刀和镊子小心剥取休眠芽中约0.3 cm～0.5 cm的芽 尖。 3 DB15/T 1648—2019 7 初代培养 7.1 初代培养基 初代培养选用MS + IBA 0.5 mg /L +6-BA 1.0 mg /L。 7.2 初代接种 在超净工作台内，在酒精灯前打开瓶盖，用枪形镊子夹取剥好的芽尖接种于预先准备好的初代培养 基上，每瓶培养基均匀接种3个外植体，芽尖基部插入培养基内约1 mm左右，芽露出，接种后将瓶口迅 速置于酒精灯火焰上灼烧2 s，盖紧瓶盖；注明编号。 7.3 培养方法 将接种完毕进行初代培养的培养瓶送到培养室，摆放在指定的组培架上。 7.4 培养环境 培养室温度在25 ℃±2 ℃，相对湿度70 ％～80 ％，光照强度1500 lx～2000 lx，光照时间12 h/d。 7.5 培养期 初代培养期为20 d，此时芽尖长到3 cm～5 cm。 8 继代培养 8.1 继代培养基 增殖继代培养选用1/2 MS + IBA 0.5 mg /L +GA3 0.5 mg /L。 8.2 继代转接 在超净工作台内，将初代培养萌发的芽尖切去老叶、基部愈伤等组织，留下2 cm～3 cm的芽苗，接 种于继代培养基中，使茎段下部插入培养基内，芽露出，接种后将瓶口迅速置于酒精灯火焰上灼烧2 s， 拧紧瓶盖。每瓶培养基均接种3个芽苗。注明编号。 8.3 培养方法 将接种完毕进行继代培养的培养瓶送到培养室，摆放在指定的组培架上。 8.4 培养环境 培养室温度25 ℃±2 ℃，相对湿度70％～80％，光照强度2000 lx～3000 lx，光照时间16 h/d。 8.5 培养期 继代培养期为30 d。 9 生根培养 4 DB15/T 1648—2019 9.1 生根培养基 生根培养基选用1/2MS + IBA 0.3 mg /L。 9.2 生根转接 当继代增殖培养不定芽高达2.0 cm～3.0 cm 时，从中剪取生长健壮、叶片舒展、叶色正常、大小 相近的不定芽接种在生根培养基上进行生根培养，每个培养瓶均匀接种8～10株不定芽