ICS 65.020.01 B 16 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1604—2019 马铃薯晚疫病菌分离保存与生理小种鉴定 技术规程 Technical Regulation for the isolation and race detection of phytophthora infestans on Potato 2019-03-15 发布 内蒙古自治区市场监督管理局 2019-06-15 实施 发 布 DB15/T 1604—2019 目 次 前 言 .............................................................................. II 1 范围 .............................................................................. 1 2 术语和定义 ........................................................................ 1 3 培养基的配置 ...................................................................... 2 4 病样采集 .......................................................................... 2 5 晚疫病菌的分离纯化与鉴定 .......................................................... 2 6 鉴别寄主的准备 .................................................................... 3 8 病情调查 .......................................................................... 3 10 菌株保存 ......................................................................... 3 11 鉴定后材料的灭活处理 ............................................................. 4 附录 A（资料性附录） 马铃薯晚疫病菌（致病疫霉菌）菌落培养特征及孢子囊形态特征 ........ 5 附录 B（规范性附录） 马铃薯晚疫病菌生理小种命名方法 .................................. 6 I DB15/T 1604—2019 前 言 本标准依据GB/T1.1-2009给出规则起草。 本标准由赤峰市农牧科学研究院提出。 本标准由自治区农业标准化技术委员会（SAM/TC 20）归口。 本标准起草单位：赤峰市农牧科学研究院。 本标准主要起草人：郝永丽、王雪洁、高博、胡海波、张金成、刘庆鹏。 II DB15/T 1604—2019 马铃薯晚疫病菌分离保存与生理小种鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了马铃薯晚疫病菌分离保存与生理小种鉴定的培养基的配置、病样采集、晚疫病菌的分 离纯化与鉴定、鉴别寄主的准备、人工接种、病情调查、生理小种确定、菌株保存、鉴定后材料的灭活 处理等内容。 本标准适用于马铃薯晚疫病菌分离保存与生理小种室内鉴定。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 生理小种 physiological race 病原物的种或变种(或专化型)内,在形态上相似而在培养性状、生理、生化、病理(致病力)或其他 特性上有差异的生物型或生物型群。 2.2 单孢分离 single spore isolation 在实体解剖镜下直接挑取单个孢子，一定条件下培养萌发成菌丝体来获得纯菌种的方法。 2.3 鉴别寄主 differentiate host 一套分别含有 R1～R11 主效抗性单基因和不含 R 基因作为对照（r）的马铃薯品种。 2.4 人工接种鉴定 artificial inoculation 在人工控制的条件下，用马铃薯晚疫病菌孢子悬浮液接种到马铃薯鉴别寄主的离体叶片上，根据接 种叶片的孢子囊产生状况及在不同鉴别寄主上的组合情况确定菌株具体所属的生理小种。 2.5 接种体 inoculant 用于人工接种鉴定用的马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）孢子悬浮液。 1 DB15/T 1604—2019 2.6 离体叶片接种法 leaf inoculate in vitro 将接种体接种到鉴别寄主植株中部复叶摘下的小叶片的方法。 3 培养基的配置 3.1 黑麦培养基 将黑麦50 g加适量自来水室温下浸泡20 h～36 h，匀浆机捣碎，55 ℃～60 ℃水浴1 h～2 h，四层 纱布过滤，上清液补水至1000 mL，加入琼脂粉12 g，分装后121 ℃高压灭菌25 min。 3.2 选择性培养基 -1 在冷却至40 ℃左右的黑麦培养基中加入利福平20 mg•L -1 苯100 mg•L 。 或氨卞青霉素200 mg•L -1 或70 %五氯硝基 4 病样采集 在晚疫病发生时期，采集具有典型症状的新鲜病叶，记录品种、采样时间、采样地点。用保鲜袋或 薯片夹叶带回实验室，贮放在4 ℃冰箱中备用。 5 晚疫病菌的分离纯化与鉴定 5.1 保湿培养分离法 将采回的病叶用水冲洗干净，晾干后，叶背朝上放入垫有湿滤纸的培养皿内，盖盖后置于 18 ℃～ 20 ℃培养箱内培养 1 d～2 d。然后挑取病斑上的霉层置于选择性培养基上，18 ℃～20 ℃培养 7 d～9 d，待菌落直径长至 2 cm～3 cm，备用。 5.2 薯片夹叶分离法 取感病品种的健康薯块清洗干净，晾干，用 75 %的乙醇溶液浸泡 30 s～40 s，取出，烧干表面残 2 存的乙醇。将薯块切成约 5 mm 厚的薯片，放在已灭菌的培养皿中。取约 1 cm 的病健交界处的病叶组 织置于已消毒的两薯片之间，18 ℃～20 ℃培养箱内培养，待薯片长出霉层后，挑取霉层接种于选择性 培养基中培养备用。 5.3 纯化 经单孢分离后挑取单孢菌落，置于选择性培养基上培养备用。 5.4 鉴定 挑取分离的少量培养体制成玻片，在 100 倍显微下观察菌体形态。当菌体形态与附录 A 相符时，则 确定该分离物为晚疫病菌。 2 DB15/T 1604—2019 6 鉴别寄主的准备 将鉴别寄主的脱毒苗移接于 MS 培养基上，15 d～20 d 后移栽到无土基质中，浇施营养液，在 20 ℃～ 23 ℃下培养约 30 d 后备用。 7 人工接种 7.1 孢子悬浮液的制备 将供试病原菌接种在黑麦培养基上，18 ℃～20 ℃培养 7 d～10 d，待大量产生孢子囊后，用无菌 水冲洗，制成菌悬液，用 2 层纱布过滤获得孢子囊悬液，置于 4 ℃冰箱 2 h～3 h，待释放出游动孢子 后，再用孔径为 12 μm 的钢丝网过滤除去孢子囊和空孢子囊壳，然后经血球计数板测数并将其浓度调 4 至约 4×10 个/mL，备用。孢子悬液当天使用当天制备。 7.2 接种 7.2.1 接种技术 摘取鉴别寄主植株中部复叶的小叶片，背面朝上置于 1.5 %的水琼脂培养基平板中，编号备用。采 用离体叶片接种法，用微量移液器吸取 20 µL 配制好的接种体，滴在每个小叶背面近中脉两侧。每菌 株每鉴别寄主接种 3 片叶，重复 3 次，以无菌水处理为对照。 7.2.2 培养条件 接种后的叶片置于 18 ℃～20 ℃的光照培养箱中培养。次日，将叶面翻转，相同条件下继续培养。 8 病情调查 8.1 调查时间 接种5 d～7 d后观察并记录病情。 8.2 病情调查方法 根据接种部位症状及是否产生孢子囊确定鉴别寄主抗、感病型。先观察接种部位症状产生情况，再 用低倍显微镜观察症状部位。各处理每次重复的叶片2/3或全部有症状且产生孢子囊的判定为感病型， 即该菌株对该寄主有毒力；全部叶片无症状或有轻微症状但无孢子囊产生的为抗病型。同一处理３次重 复的结果不一致视为无效处理。 9 生理小种确定 根据供试菌株在鉴别寄主上的抗、感病型确定所属生理小种。各生理小种在鉴别寄主上的抗、感病 型模式见附录B。 10 菌株保存 将经过接种鉴定确定为马铃薯晚疫病菌并且纯化的菌株转移到黑麦斜面培养基培养，当斜面上长满 菌丝后，灌注灭菌过的液体石蜡密封，置于 13 ℃黑暗中保存。 3 DB15/T 1604—2019 11 鉴定后材料的灭活处理 将接种后剩余的接种体、接种鉴定后的植株残留物等集中到容器中经 121 ℃、20 min 灭活处理。 4 DB15/T 1604—2019 AA 附 录 A （资料性附录） 马铃薯晚疫病菌（致病疫霉菌）菌落培养特征及孢子囊形态特征 马铃薯晚疫病菌（致病疫霉菌）菌落为白色棉絮状（见图 A.1）。菌丝为无色、无隔膜。孢囊梗无 色，具 3～4 分枝，在产生每个孢子囊的部位，孢囊梗膨大成节状，节基部钝圆而顶端尖细。孢子囊单 胞无色，卵圆形，顶端有乳状突起（见图 A.2）。 图A.1 马铃薯晚疫病菌（致病疫霉菌）菌落形态 图A.2 马铃薯晚疫病菌（致病疫霉菌）菌丝及孢子囊形态 5 DB15/T 1604—2019 BB 附 录 B （规范性附录） 马铃薯晚疫病菌生理小种命名方法 根据各供试菌株在11个含抗性单基因的鉴别寄主上的表现症状来进行马铃薯晚疫病菌生理小种命 名，所有的生理小种均能侵染不具任何抗性基因的品种（r）,如生理小种1.2.3.4，则表明该生理小种 除了能侵染不具任何抗性基因的品种（r）外，还可侵染 R1、R2、R3和 R4，并表现出发病症状，而对 R5、 R6、R7、R8、R9、R10和 R11 均不能侵染，不能表现发病症状；如生理小种 3.7.8.10.11，则表明该生 理小种除了能侵染不具任何抗性基因的品种（r）外，还可侵染 R3、R7、R8、R10和 R11，并表现出发 病症状，而对 R1、R2、R4、R5、R6和 R9 均不能侵染，不能表现发病症状；依此类推，进行马铃薯晚 疫病菌生理小种鉴定。 _________________________________ 6