(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210902360.5 (22)申请日 2022.07.29 (71)申请人 贵州中医药大学 地址 550025 贵州省贵阳市花溪区花溪大 学城栋青路4号 (72)发明人 杨昌贵　周涛　江维克　袁青松　 沈渊文　肖承鸿　 (74)专利代理 机构 贵阳贵知 知识产权代理事务 所(普通合伙) 52115 专利代理师 曾香兰　蒋琳琳 (51)Int.Cl. G01N 1/28(2006.01) G01N 1/38(2006.01) G01N 30/02(2006.01) G01N 30/72(2006.01) (54)发明名称 一种薏苡仁黄曲霉毒素B1基体标准物质的 制备方法及其定值方法 (57)摘要 本发明提供了一种薏苡仁黄曲霉毒素B1基 体标准物质的制备方法及其定值方法， 主要采用 “反式培养 ”技术进行薏苡仁中黄曲霉毒素B1基 体标准物质的制备技术的研究， 通过对薏苡仁中 黄曲霉菌培养 条件的考察， 同时考察辐照、 干燥、 粉碎、 包装等工艺对毒素均匀性、 稳定性的影 响， 建立薏苡仁中黄曲霉毒素B1基体标准物质的制 备工艺， 并应用此技术制备黄曲霉毒素B1基体标 准物质， 为中药材及农产品黄曲霉毒素的检测校 准和质量控制提供计量标准。 权利要求书3页 说明书19页 附图3页 CN 115436119 A 2022.12.06 CN 115436119 A 1.一种薏苡仁黄曲霉毒素B1基 体标准物质的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)黄曲霉菌孢子悬浮液的制备； (2)薏苡仁 药材的接种； (3)接种薏苡仁 药材的灭菌和干燥； (4)接种薏苡仁 药材的粉碎、 过筛和混匀； (5)薏苡仁黄曲霉毒素B1基 体标准物质分装、 灭菌、 保存。 2.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 步骤(1)所述黄曲霉菌孢子悬浮液的 制备， 具体方法为： 在无菌操作台中， 将 黄曲霉菌接种到PDA培养基中培养3天， 再接种到PDA 培养基中， 放入光照培养箱中培养5天， 收集黄曲霉菌孢子悬浮液， 用血球计数板， 将孢子浓 度调节至105CFU·mL‑1， 得黄曲霉菌孢子悬浮液。 3.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 步骤(2)所述薏苡仁药材的接种， 具体 方法为： 取薏苡仁药材， 以功率为650w微波灭菌90 s， 然后在超净工作台中用无菌水漂洗， 使 水分活度大于0.8， 每500g薏苡仁接种孢子悬浮液5mL， 摇动使黄曲霉菌液均匀覆盖于薏苡 仁表皮上， 置于温度 28℃， 相对湿度 90％的培养箱中培养5天， 得接种薏苡仁药材， 并检测其 黄曲霉毒素含量。 4.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 步骤(3)所述接种薏苡仁药材的灭菌 和干燥， 具体方法为： 接种后的薏苡仁药材用剂量为4kG的钴60辐射 灭菌； 再以50℃干燥3h， 得干燥后的接种薏苡仁 药材。 5.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 步骤(4)所述接种薏苡仁药材的粉碎、 过筛和混匀， 具体方法为： 取干燥后的接种薏苡仁药材， 置入 液氮中浸泡10s， 用13000r/min 的刀式粉碎机粉碎， 过四号筛得产毒薏苡仁粉末， 可用空 白薏苡仁粉末调节其浓度， 置于V 型混合混匀仪中， 以240r/mi n的转速混合24小时， 得薏苡仁黄曲霉毒素B1基 体标准物质。 6.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 步骤(5)所述薏苡仁黄曲霉毒素B1基 体标准物质分装、 灭菌、 保存； 具体方法为： 在干燥洁净的环 境中， 将薏苡仁黄曲霉毒 素B1基 体标准物质装入带有内盖的棕色玻璃瓶中， 采取外加铝箔袋抽真空密封包装， 每瓶装15g， 用剂量为4kG的钴60辐射灭菌， 在 ‑20℃低温环境下避光保存。 7.一种用于权利要求1 ‑6任一项制备的薏苡仁黄曲霉毒素B1基体标准物质的定值方 法， 其特征在于， 所述定值方法为： 采用同位素内标结合超高效液相色谱串联质谱的方法进 行检测。 8.根据权利要求7所述的定值方法， 其特征在于， 所述同位素内标结合超高效液相色谱 串联质谱的方法为： 色谱与质谱条件： 色谱柱为Waters  HSS T3， 规格为100 ×2.1mm， 1.8 μm； 以0.05 ‑0.15％ 甲酸水为 流动相A， 乙腈 为流动相B； 流速 0.4mL·min‑1； 柱温40℃； 梯度洗脱条件为： 采用ESI离子源， 正离子模式扫描， 多反应监测模式MRM采集数据， 各化合物的质谱参数 为：权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115436119 A 2混合对照品溶液的配制： 精密量取黄曲霉毒素B1对照品适量， 用甲醇溶解， 配置为 100ng·kg‑1的AFB1储备液； 分别精密吸取AFB1储备液5、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40 μL于1mL的 容量瓶中， 分别加入4 μL[13C17]‑AFB1内标液， 用甲醇稀释至刻度， 配置 成浓度依次为0.5、 1、 1.5、 2、 2.5、 3、 3.5、 4 ng·mL‑1的标准溶 液， 每个标准溶 液中[13C17]‑AFB1浓度为2ng ·mL‑1； 供试品溶液的制备： 取薏苡仁粉末3 ‑5g， 精密称定， 置于锥形瓶中， 加入氯化钠1g， 精密 加入60‑80％甲醇溶液25mL， 以频率为180r ·min‑1振荡提取1h， 以频率为5000r ·min‑1离心 5‑10分钟， 精密量取上清液3mL， 置20mL量瓶中， 用水稀释至刻度， 摇匀， 用0.22 μm微孔滤膜 滤过； 精密量取续滤液10mL， 通过黄曲霉毒素总量的免疫亲合柱， 流速每 分钟3mL， 用水10mL 洗脱， 洗脱液弃去， 使空气进入柱子， 将水挤出柱子， 再用适量甲醇洗脱， 收集洗脱 液， 置2mL 量瓶中， 并用甲醇稀释至刻度， 摇匀， 用0.22 μm微孔滤膜滤过； 精密量取[13C17]‑AFB1 4 μL于 高液小瓶中， 用续滤 液液定容至1mL， 摇匀， 即得； 测定法： 分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各3 ‑10 μL， 注入超高效液相色谱 ‑ 串联质谱仪， 测定， 计算， 即得薏苡仁黄曲霉毒素B1基 体标准物质的定值。 9.根据权利要求8所述的定值方法， 其特征在于， 所述同位素内标结合超高效液相色谱 串联质谱的方法为： 色谱与质谱条件： 色谱柱为Waters  HSS T3， 规格为100 ×2.1mm， 1.8 μm； 以0.08 ‑0.12％ 甲酸水为 流动相A， 乙腈 为流动相B； 流速 0.4mL·min‑1； 柱温40℃； 梯度洗脱条件为： 采用ESI离子源， 正离子模式扫描， 多反应监测模式MRM采集数据， 各化合物的质谱参数 为： 混合对照品溶液的配制： 精密量取黄曲霉毒素B1对照品适量， 用甲醇溶解， 配置为 100ng·kg‑1的AFB1储备液； 分别精密吸取AFB1储备液5、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40 μL于1mL的 容量瓶中， 分别加入4 μL[13C17]‑AFB1内标液， 用甲醇稀释至刻度， 配置 成浓度依次为0.5、 1、 1.5、 2、 2.5、 3、 3.5、 4 ng·mL‑1的标准溶 液， 每个标准溶 液中[13C17]‑AFB1浓度为2ng ·mL‑1； 供试品溶液的制备： 取薏苡仁粉末4 ‑5g， 精密称定， 置于锥形瓶中， 加入氯化钠1g， 精密 加入65‑75％甲醇溶液25mL， 以频率为180r ·min‑1振荡提取1h， 以频率为5000r ·min‑1离心 5‑8分钟， 精密量取上清液3mL， 置20mL量瓶中， 用水稀释 至刻度， 摇匀， 用0.22 μm微孔滤膜滤 过； 精密量取续滤液10mL， 通过黄曲霉毒素总量的免疫亲合柱， 流速每 分钟3mL， 用水10mL洗 脱， 洗脱液弃去， 使空气进入柱子， 将水挤出柱子， 再用适量甲醇洗脱， 收集洗脱 液， 置2mL量权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 115436119 A 3