(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210953055.9 (22)申请日 2022.08.10 (71)申请人 无锡生基医药 科技有限公司 地址 214174 江苏省无锡市惠山经济开发 区惠山大道1719- 6号一层A区 (72)发明人 雷静　王沁瑜　周园　蒋鑫　 程志茹　徐刚明　郑艳军　陈琪　 (74)专利代理 机构 上海市汇业 律师事务所 31325 专利代理师 王函 (51)Int.Cl. G01N 21/33(2006.01) G01N 1/28(2006.01) G01N 1/38(2006.01) (54)发明名称 一种定量检测Pluro nic F-68的方法 (57)摘要 本发明公开了一种定量检测PluronicF ‑68 的方法， 该方法应用显色法， 快速、 准确、 特异地 定量检测Pluronic F‑68的含量； 适用于生产工艺 过程中的rAAV中间品， rAAV终产品， 以及其他生 物制品； 所述方法操作简单， 重复性好， 灵敏度 高。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 115326736 A 2022.11.11 CN 115326736 A 1.一种定量检测Pluro nic F‑68的方法， 包括以下步骤： 1).将Pluronic  F‑68配制为10mg/mL溶液， 分别稀释至31.25、 62.5、 125、 250、 500和 1000 μg/mL； 2).分别取稀释后的Pluronic  F‑68溶液至离心管中， 水为阴性对照， 每支离心管中， 分 别加入10 0mM硫氰酸钴溶 液、 乙酸乙酯和无 水乙醇， 漩涡震荡均匀； 3).将每支离心管在冰上放置10分钟时间， 其后， 在2 ‑8℃温度下离心， 将离心管中的上 面两层液相介质移走； 4).用乙酸乙酯清洗 蓝色固相沉淀， 直至乙酸乙酯没有颜色； 5).移走乙酸乙酯， 并在离心管中加入乙腈， 使蓝色固相沉淀溶解在乙腈中； 6).将分光光度计用乙腈调零， 319nm为光吸收波长， 625nm为参考波长， 在319nm和 625nm处均调零； 7).以625nm为参考波长， 测量各离心管中的样品在319nm处的光吸收值， 每个样品至少 测量三次， 绘制Pluro nic F‑68浓度‑光吸收值 λ319nm‑625nm标准曲线， 计算线性相关系数R2。 2.根据权利要求1所述的一种定量检测Pluronic  F‑68的方法， 其特征在于， 步骤2)中， 所述Pluro nic F‑68溶液的加入量︰ 所述10 0mM硫氰酸钴溶 液的加入量 为1～3︰ 0.5～1.5 。 3.根据权利要求1或2所述的一种定量检测Pluronic  F‑68的方法， 其特征在于， 步骤2) 中， 所述Pluro nic F‑68溶液的加入量︰ 所述乙酸乙酯的加入量 为1～3︰ 1～3 。 4.根据权利要求1或2所述的一种定量检测Pluronic  F‑68的方法， 其特征在于， 步骤2) 中， 所述Pluro nic F‑68溶液的加入量︰ 所述无 水乙醇的加入量 为1～3︰ 0.4～1.2。 5.根据权利要求1或2所述的一种定量检测Pluronic  F‑68的方法， 其特征在于， 步骤3) 中， 离心的转速大于或等于15,0 00g， 时间为5 ‑10分钟。 6.根据权利要求1或2所述的一种定量检测Pluronic  F‑68的方法， 其特征在于， 步骤5) 中， 所述乙腈的加入量︰ 所述Pluro nic F‑68溶液的加入量 为2～10︰ 1～3 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115326736 A 2一种定量 检测Pluronic F‑68的方法 技术领域 [0001]本发明涉及一种检测Pluronic  F‑68的方法， 特别涉及一种应用显色法定量检测 Pluronic F‑68的方法。 背景技术 [0002]根据市场调 研机构Fortune  Business  Insights发布的报告， 2019年基因治疗市 场规模为36.1亿美元， 预计到2027年将达到356.7亿美元， 预测期内的年均复合增长率 (CAGR)为33 .6％。 目前， 基因药物的病毒类载体主要是腺相关病毒(Adeno ‑ AssociatedVirus， 缩略为A AV)和腺病毒(Aden ovirus)两大类。 [0003]2012年11月2日， 以1型AAV为载体表达脂蛋白脂酶的药物Glybera被欧盟正式批准 上市， 递送表达编码 脂蛋白脂肪酶(lipoprteinlipase， 缩略为LPL)的转基因， 用于治疗LPL 缺失患者， 但后来于2017年退市。 2017年12月20日， 美国Spark  Therapeutics公司开发的 Luxturna获FDA批准， 用于治疗Leber先天性黑蒙2型(Leber ’s Congenital Amaurosis  2, 缩略为LCA2)， 由于RPE65(Retinal  Pigment Epithelium ‑specific 65kDa Protein， 缩略 为RPE65)基因突变而导致失明的患者。 它使用AAV2平台来递送 正常RPE65基因， 采用在视网 膜下腔直接注射的方法将病毒导入眼球中。 这是美国第一个利用AAV病毒作为载体， 体内直 接用药， 用于治疗 “基因缺失遗传病 ”的基因治疗药物。 2019年5月24日， 美国FDA批准 Novartis公司AveXis  Inc.开发的基因治疗产品Zolgensma， 应用AAV9介导表达运动神经元 存活蛋白SMN1(S urvival Motor Neuron Gene 1， 缩略为SMN1)， 用于治疗SMN ‑1缺失的脊髓 性肌萎缩症的婴儿患者。 [0004]这些基因治疗的成功， 激 发了rAAV基因药物的研发热潮。 AAV 是一种隶属细小病毒 科(Parvoviridae)， 无包膜的单链线状DNA病毒， 外形为裸露的20面体颗粒， 大小为20～ 26nm。 AAV不能独立复制， 只有在辅助病毒(如腺病毒、 单纯疱疹病毒、 痘苗病毒)存在时， 才 能进行复制。 AAV病毒的基因组约4700bp， 包括上下游两个开放读码框架(Open  Reading  Frame， 缩略为ORF)， 位于分别由145个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(Inverted   Terminal  Repeats,缩略为ITR)之间。 在两个ITR之间编码两个 蛋白： Cap和Rep。 其中Rep基 因参与病毒的复制和整合， Cap基因编码病毒衣壳 蛋白。 [0005]rAAV病毒基因治疗制品的适应症主要集中在单基因遗传病领域,包括血友病、 杜 氏肌营养不良症、 先天性黑蒙症、 脂蛋白脂酶缺乏症和阿尔茨海默症等。 与传统的替代疗法 相比,rAAV制品在基因层面进行修复,单次给 药即有可能达 到长期疗效。 [0006]根据衣壳蛋白的不同,AAV病毒可分为12种血清型和100多种变体。 不同血清型对 人体不同组织的靶向性和感染效率存在差异,如AAV8对肝脏组织细胞感染效率较高,AAV1 和AAV9则分别对心脏细胞和骨骼肌细胞更为敏感。 rAAV病毒 载体对于骨骼肌、 视网膜、 肝细 胞、 心脏平 滑肌细胞、 神经 元细胞、 胰岛B 细胞、 关节 滑膜细胞等具有良好的感染效果。 [0007]rAAV病毒是安全级别最高的基因治疗载体。 rAAV病毒源于 非致病的野生型腺相关 病毒， rAAV病毒 具有结构简单、 无致病性,可感染分裂期 /非分裂期细胞,不整合至基因组等说　明　书 1/4 页 3 CN 115326736 A 3