(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210987383.0 (22)申请日 2022.08.17 (71)申请人 厦门大学 地址 361003 福建省厦门市思明南路42 2号 申请人 嘉庚创新实验室 (72)发明人 张惠敏　郭俊南　杨朝勇　朱志　 (74)专利代理 机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 专利代理师 温可睿 (51)Int.Cl. C12M 1/42(2006.01) C12M 1/34(2006.01) C12M 1/00(2006.01) B01L 3/00(2006.01) C12Q 1/6869(2018.01) (54)发明名称 一种基于数字微流控技术的单细菌基因组 测序方法 (57)摘要 本发明涉及单细菌测序领域， 具体涉及一种 基于数字微流控技术的单细菌基因组测序方法。 本发明开发了基于全自动数字微流控平台(DMF) 的适用于 单细菌的微型裂解体系、 数字微流控芯 片及单细菌基因组测序技术， 实验结果表明， 裂 解体系单细菌细胞裂解迅速、 基因完整度好、 组 装效率及基因覆盖度高； 同时该裂解体系及基于 该裂解体系的微流控芯片与DMF的联用， 减少了 试剂的损耗， 降低了样品污染风险、 提高了反应 效率、 减小了扩增偏差， 使之更适用于单细菌基 因组测序。 权利要求书2页 说明书8页 附图2页 CN 115197840 A 2022.10.18 CN 115197840 A 1.数字微流控芯片， 其特征在于， 包括细菌捕获及裂解单元、 液滴生成通道、 储液池单 元和电极接口； 所述储 液池单元的数量不低于5个， 分别存储有裂解试剂A、 裂解试剂B、 中和 液、 扩增试剂和菌液； 其中， 裂解试剂A包括： 800～2400U/ μL溶菌酶、 400～1200mM二硫苏糖醇和2～6mM乙二胺四 乙 酸； 裂解试剂B包括： 3 00～500mM KOH、 80～120mM二硫苏糖醇和5～15mM乙二胺四乙酸； 中和液包括： 0.8～1.2M  Tris‑HCl溶液； 扩增试剂包括： 随机引物、 DNA聚合酶、 dNTP、 扩增缓冲液和二硫苏糖醇。 2.根据权利要求1所述的数字微流控芯片， 其特征在于， 所述扩增试剂中的DNA聚合酶 包括： vent  DNA聚合酶、 T7  DNA聚合酶、 T 4 DNA聚合酶、 DNA聚合酶I、 S ulfolobus  DNA聚合酶 IV、 phi29  DNA聚合酶、 B st DNA聚合酶、 Equiphi29  DNA聚合酶中的任意一种或两种以上的 组合。 3.根据权利要求1或2所述的数字微流控芯片， 其特征在于， 还包括荧光染料、 填充油和 纯化试剂； 所述荧光染料选自PI、 DAPI， SYTO ‑9,FM 1‑43FX,FM 4‑64,FM 4‑64FX,BacLigh   Bacterial  Stains,Alexa Fluor 647NHS Ester,Cel lTrackerTM红色CMTPX或FM 1‑43； 所述填充油选自矿物油、 氟油、 硅烷油、 二甲基硅油； 所述纯化试剂选自柱纯化试剂或磁珠 纯化试剂。 4.根据权利要求1～3任一项所述的数字微流控芯片， 其特征在于， 所述的裂解试剂A、 裂解试剂B、 中和液的体积比为1:(1～1.5):(1～1.5)； 所述扩增试剂与裂解试剂A、 裂解试 剂B和中和液的混合液的体积比为1:6.5 。 5.根据权利要求1所述的数字微流控芯片， 所述细菌捕获及裂解单元包括： 上极板基 底， 设置在所述上极板基底下表 面的ITO涂层， 设置于所述ITO涂层下表面的上疏水层； 下极 板基底， 设置于所述下极板基底上表 面的介质层， 嵌设于所述介质层内的电极， 设置在所述 介质层上表面的下疏水层， 支撑于所述下疏水层和所述上疏水层之间的支撑体， 所述上疏 水层、 所述下疏水层和所述支撑体之间形成液滴生成通道， 所述下疏水层嵌设有 亲水凹槽， 所述亲水 凹槽的上槽口与所述液滴生成通道相通； 所述液滴生成通道的通口与所储液池单 元连通； 所述电极接口与所述电极相连接 。 6.根据权利要求5所述的数字微流控芯片， 其特征在于， 所述亲水凹槽为中空的圆柱形 结构， 直径为15 0～300 μm， 与每 个储液池皆有2个电极以上的距离 。 7.根据权利要求5所述的数字微流控芯片， 其特征在于， 所述的储液池尺寸为1mm × 1mm， 所述储液池直径与通道直径的比例为(5～8)： 1。 8.数字微流控装置， 其特征在于， 包括权利要求1～7任一项所述的数字微流控芯片、 集 成电路和成像系统； 所述的集成电路与数字微 流控芯片的电极接口相连。 9.单细菌基因组测序的方法， 其特征在于， 包括权利要求1～7任一项所述的数字微流 控芯片， 和/或权利要求8所述的数字微流控装置进 行单细菌的分离捕获、 核酸扩增、 文库构 建和基因 组测序。 10.根据权利要求9所述的方法， 其特 征在于， 具体包括： 菌液经染色后， 置于数字微流控芯片的储液池中， 以填充油封闭芯片后， 集成电路控制权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115197840 A 2电极通断电， 使菌液通过 液滴生成通道 移动至亲 水凹槽， 分离捕获单个细菌； 控制电极通断电， 依次使裂解试剂A、 裂解试剂B、 中和液和扩增试剂通过液滴生成通道 进入亲水凹槽， 然后进行扩增； 将扩增产物经 纯化、 文库构建后， 进行测序。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115197840 A 3