(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211008947.8 (22)申请日 2022.08.22 (71)申请人 首都医科 大学宣武医院 地址 100053 北京市西城区长 椿街45号 申请人 中国科学院微电子 研究所　 首都医科 大学附属北京潞河医院 (72)发明人 赵海苹　赵阳　黄成军　耿晓坤　 李宇昂　李雪　 (74)专利代理 机构 北京开阳星知识产权代理有 限公司 1 1710 专利代理师 董亚男 (51)Int.Cl. C12M 3/06(2006.01) C12M 1/12(2006.01) C12M 1/00(2006.01)C12N 5/078(2010.01) (54)发明名称 一种细胞分选装置及免疫细胞分选方法 (57)摘要 本发明涉及细胞分离技术领域， 尤其涉及一 种细胞分选装置及免疫细胞分选方法。 包含衬底 结构、 细胞滤膜和上盖； 衬底结构上设置有至少 一个凹坑， 凹坑的开口面积大于坑底的面积， 且 坑底的投影在开口的投影面积内； 凹坑内设置有 上盖， 上盖将凹坑内的空间全部填充； 细胞滤膜 设置于衬底结构和上盖 之间； 凹坑的内壁上设置 有第一凸起， 上盖的外壁上设置有第二凸起。 利 用本发明实施例的装置和可实现易于重复的免 疫细胞的单细胞样本的制备， 具有高效、 高通量、 高去除率和低刺激性的实际应用能力。 权利要求书1页 说明书10页 附图5页 CN 115449483 A 2022.12.09 CN 115449483 A 1.一种细胞分选装置， 其特 征在于， 包 含： 衬底结构、 细胞 滤膜和上盖； 所述衬底结构上设置有至少一个凹坑， 所述凹坑的开口面积大于坑底的面积， 且所述 坑底的投影在所述 开口的投影面积内； 所述凹坑内设置有所述上盖， 所述上盖将所述凹坑内的空间全部填充； 所述细胞 滤膜设置 于所述衬底结构和所述上盖之间； 所述凹坑的内壁上设置有 多个第一凸起， 所述上盖的外壁上设置有 多个第二凸起； 所述坑底内设置有出口； 所述上盖和所述细胞 滤膜之间的夹缝均为入口。 2.根据权利要求1所述的细胞分选装置， 其特 征在于， 所述凹坑 为倒置的圆锥或棱锥。 3.根据权利要求2所述的细胞分选装置， 其特 征在于， 所述棱锥选自正三棱锥、 正四棱锥、 正五棱锥、 正六棱锥、 正七棱锥、 正八棱锥、 正九棱 锥、 正十棱锥、 正十一 棱锥和正十二 棱锥； 所述出口设置 于所述圆锥或所述 棱锥的顶点。 4.根据权利要求1所述的细胞分选装置， 其特征在于， 所述第 一凸起为半球体或由半球 体与底座组合而成； 所述底座选自圆柱体、 圆台体或多棱柱体， 所述底座的上表面与所述半 球体为圆滑过渡。 5.根据权利要求1所述的细胞分选装置， 其特征在于， 所述第 一凸起的底部直径或边长 为0.1mm～10mm； 所述第一凸起的高度为0.1mm～10mm； 所述第一凸起沿所述凹坑的内壁至 少设置一 排。 6.根据权利要求1所述的细胞分选装置， 其特征在于， 所述细胞滤膜的孔隙率为11％～ 14％， 厚度为12 μm～ 27 μm， 孔径为3 μm～8 μm； 孔径优选为3 μm～5 μm； 所述细胞滤膜为浸泡于含有质量百分比浓度为0.5～ 1.5％的BSA溶液中进行表面 蛋白 修饰后的细胞 滤膜。 7.根据权利要求1所述的免疫细胞分选装置， 其特征在于， 多个所述第 二凸起用于撑起 所述细胞 滤膜， 同时形成用于液体流 通的通路； 所述第二凸起的高度为1 μm～5 000 μm。 8.根据权利要求1所述的细胞分选装置， 其特征在于， 所述衬底结构和所述上盖为透明 树脂材料； 所述细胞 滤膜选自聚对苯二甲酸乙二醇酯材 料。 9.一种免疫细胞分选方法， 其特征在于， 使用 如权利要求1～8任一项所述的细胞分选 装置对待测样本中的目的细胞进行分离， 至少包括 步骤： S1、 采用不含钙镁离 子的DPBS溶液润洗所述细胞 滤膜： S2、 从所述入口加入所述待测样本： S3、 过滤完成后， 收集所述细胞滤膜上分选得到的目的细胞： 采用不含钙镁离子的DPBS 溶液冲洗所述上盖表面和所述细胞 滤膜的表面， 得到含有目的细胞的悬浮液。 10.根据权利要求9所述方法， 其特 征在于， 在S2中， 将血 液样本稀释后加入， 稀释的倍数为1～3倍； 在S2中， 加入所述待测 样本后， 采用DPBS溶液清洗盛放所述待测 样本的容器， 将清洗液 从所述入口加入所述细胞分选装置； 清洗用的D PBS溶液的体积为所述血 液样本的2 ～5倍； 在S3中， 所述冲洗所用的D PBS溶液为所述血 液样本体积的8～15倍。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115449483 A 2一种细胞分选装 置及免疫细胞分选方 法 技术领域 [0001]本发明涉及细胞分离技术领域， 尤其涉及一种细胞分选装置及免疫细胞分选方 法。 背景技术 [0002]免疫细胞在人体血液中的含量很低， 却含有丰富的身体免疫和疾病诊断信息。 免 疫细胞的成功分离和富集是后续单细胞测序和疾病的筛查的首要步骤， 高通量、 高活性、 高 纯度以及尽可能低的细胞刺激是至关重要的。 随着单细胞测序技术的推广， 应用于免疫细 胞的单细胞测序拓展了对传统免疫细胞分型的认识， 快速推动了对疾病的病理过程的理解 和治疗靶点的发现。 然而， 对于外周血细胞和骨髓来源的免疫细胞如中性粒细胞、 单个核细 胞的制备， 为了去除红细胞和血小板， 不可避免的要进 行离心和裂解的步骤。 由于疾病状态 下的免疫细胞异常敏感， 已有的研究显示离心或者化学方法可能会激活或者损伤免疫细 胞， 这可能会造成测序结果的偏差， 从而影响对免疫细胞分型认识的准确性。 除此之外， 在 分离免疫细胞时， 血小板及其携带的RNA的污染， 也会影响测序结果， 然而 血小板的去除， 没 有十分有效的方法。 [0003]目前的细胞分离方法普遍存在低通量、 工艺复杂等问题， 在对血小板去除和免疫 细胞的低刺激性方面， 与临床分析的期望仍然存在较大差距。 [0004]当前已经有一些方法用于临床检测， 较为广泛的传统方法主要有裂解、 密度梯度 离心和流式荧光激活细胞分选(FACS)。 虽然这些传 统方法在通量和应用方面存在优势， 但 都存在其固有的缺点。 流式荧光激活细胞分选具有复杂的系统， 成本较高， 而且在操作前需 要对细胞进行染色， 这会对细胞造成不可逆的损伤。 离心和裂解的操作过程通常需要较长 时间， 需使用专 业人士和设备操作。 而且裂解液是利用渗透压原理使得 红细胞破裂， 已有研 究表明裂解液会使得白细胞表 面受损。 此外， 有报道称， 多次高速离心产生的高加速度和冲 击力会损害白细胞， 活化中性粒细胞， 甚至是诱导细胞死亡。 这也限制了后续的医学检测和 生物分析。 [0005]随着临床医疗的发展， 一系列的微流控芯片被提出并应用于细胞分选。 分选方法 可以分为主动分选和被动分选。 其中主动分选包括基于电、 声、 光、 磁和机械力的分选方法， 在富集和操作稀有细胞领域已取得极大的成果。 被动分选主要是基于细胞形态尺寸相关的 流体力差异进行细胞分选， 包括利用惯性力、 压缩流、 确定侧向位移和微过滤等。 但是微流 控分选通常需要对靶细胞进行特殊标记， 分选设备复杂且昂贵； 需要设计集成复杂精细的 结构， 加工工艺复杂； 此外， 基于血细胞分选的微型芯片都会面临着细胞堵塞、 样本低通量 以及细胞活性受损的问题。 因此， 基于尺寸的二维筛分方法具有无标签、 简单、 快速等主要 优点， 更加适用与血细胞的分选和富 集。 [0006]然而， 对于微米孔径的筛孔膜， 由于表面张力的存在， 存在一个液体过孔的压强阈 值， 即需要在膜的一面施加一个较高的压强， 才能使液体突破和穿过膜孔， 实现过滤的效 果。 特别是对于低孔隙率(如25％及以下的孔隙率)小孔径的微米孔径滤膜(如适合于红细说　明　书 1/10 页 3 CN 115449483 A 3