(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211021476.4 (22)申请日 2022.08.24 (71)申请人 首都医科 大学附属北京安贞医院 地址 100029 北京市朝阳区安贞路2号 (72)发明人 林煌　马嘉兴　赵银花　崔玥　 (74)专利代理 机构 北京三聚阳光知识产权代理 有限公司 1 1250 专利代理师 李红团 (51)Int.Cl. C12N 5/077(2010.01) C12M 1/24(2006.01) C12M 1/36(2006.01) C12M 1/00(2006.01) C12M 3/00(2006.01) A61K 35/36(2015.01)A61P 17/02(2006.01) A61K 8/99(2017.01) A61K 8/98(2006.01) A61Q 19/08(2006.01) (54)发明名称 一种湿盒碎片贴壁自体成纤维细胞培养方 法 (57)摘要 本发明提供了一种湿盒碎片贴壁自体成纤 维细胞培养方法， 包括将皮肤组织处理为组织碎 片贴于培养瓶中进行湿盒贴壁培养的步骤。 本方 法免去胰蛋白酶消化对细胞的损伤， 以细小碎片 的方式， 将皮肤组织均匀贴附于培养瓶中， 在相 同组织大小的条件下， 最大程度提高组织贴壁面 积和贴壁效率； 采用湿盒贴壁法， 可以保持培养 瓶内湿度， 减少细胞干燥死亡， 延长组织贴壁时 间， 降低贴壁时间控制的难度， 提高组织贴壁的 成功率； 优化组织间隔， 最大化细胞间相互作用， 促进增殖， 并使用无血清的成 纤维细胞完全培养 基培养， 在体外培养阶段避免伦理问题。 权利要求书1页 说明书6页 附图4页 CN 115161273 A 2022.10.11 CN 115161273 A 1.一种湿盒碎片贴壁自体成纤维细胞培养方法， 其特征在于， 所述方法包括将皮肤组 织处理为组织碎片贴于 培养瓶中进行贴壁培 养。 2.根据权利要求1所述的方法， 其中所述贴壁培 养在湿盒中进行。 3.根据权利要求2所述的方法， 其中所述贴壁培养中将组织碎片贴壁的培养瓶倒置， 在 贴壁之前向倒置 培养瓶的下部中加入培 养基。 4.根据权利要求1 ‑3任一项所述的方法， 其中所述组织碎片大小为0.1mm*0.1mm ‑ 0.5mm*0.5mm。 5.根据权利要求 4所述的方法， 其中所述组织碎片大小为0.2m m*0.2mm。 6.根据权利 要求1‑5任一项所述的方法， 其中将所述组织碎片间隔1mm ‑5mm贴于培养瓶 中。 7.根据权利要求6所述的方法， 其中将所述组织碎片间隔3m m贴于培养瓶中。 8.根据权利要求1 ‑7任一项所述的方法， 其中所述方法包括用含青霉素或链霉素的无 菌缓冲液的容器转移皮肤组织的步骤； 以及用含青霉素或链霉素的无菌缓冲液清洗并减去 多余组织的步骤。 9.根据权利要求1 ‑7任一项所述的方法， 其中所述方法包括将培养瓶倒置后， 加入成纤 维细胞无血清完全培 养基培养的步骤。 10.根据权利要求9所述的方法， 其中加入的培养基为4ml成纤维细胞无血清完全培养 基。 11.根据权利要求10所述的方法， 其中所述培 养在5％CO2， 37℃培养箱中进行。 12.根据权利要求1 ‑11任一项所述的方法在制备美容用、 伤口治疗用成纤维细胞中的 用途。 13.根据权利要求12所述的方法在制备美容用、 伤口治疗用成纤维细胞中的用途， 所述 的美容包括但不限于出于医疗目的或者非 医疗目的处理法令纹、 皮肤松弛、 皱纹、 脱发的方 法。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115161273 A 2一种湿盒碎片贴壁自体成纤维细胞培养方 法 发明领域： [0001]本申请涉及细胞培养， 特别是自体成纤维细胞培养技术领域。 具体地， 本申请提供 了一种湿盒碎片贴壁自体成纤维细胞培 养方法。 背景技术： [0002]成纤维细胞是真皮组织中最主要的组成部分， 在伤口的愈合过程中起到至关重要 的作用。 成纤维细胞在皮肤修复和再生中的潜力逐渐被认识， 如： 体外培养并通过基因转 染 将其诱导转化为 “类心肌细胞 ”对慢性心力衰竭进 行细胞移 植治疗成为热点； 自体成纤维细 胞移植通过分泌生长因子及细胞 因子促进伤口再上皮化、 细胞外基质形成、 抑制疤痕增长， 对烧伤和糖尿病足的治疗起到非常显著的效果。 自体真皮成纤维细胞诱导了皮肤功能的正 常恢复和 最小的瘢痕。 与同种异体真皮成纤维细胞相比， 移植自体真皮成纤维细胞具有更 好的生存能力， 促进了伤口 的再上皮化和伤口愈合。 [0003]改善法令纹、 面部松弛、 除皱、 雄激素性脱发等长期以来都是以手术治疗作为主要 手段， 其效果虽然持久， 然而术后长时间的恢复期， 和术后并发症如： 瘢痕， 术后水肿及感染 等都给求美者带来了很大不便。 因此对于微创治疗的需求 随之增加， 如今越来越多的填充 材料及药物应用于临床， 肉毒素以及如透明质酸等美容填充材料被广泛开发。 然而因为填 充材料在注射部位的吸收、 代谢， 因此需要不断地定期进行注射才能维持效果。 此外如； 过 敏、 皮肤色素沉淀、 皮下结节、 栓塞等并发症也是填充治疗的一大难题。 成纤维细胞在皮肤 结构和完整性中起到至关重要的作用。 使用自体成纤维细胞作为填充物注射到真皮， 可以 有效的避免异体填充物所导致的过敏， 并且自体成纤维细胞持续分泌的胶原蛋白和各种细 胞外基质蛋白可以使 治疗的持续时间大 大延长。 [0004]自体成纤维细胞作为一种细胞治疗的方法， 安全性是有所保证的。 2011年， FDA批 准将自体成纤维细胞注入真皮， 以改善成年人中度至严重的面部鼻唇沟皱纹的外观 (LAVIV， Fibroc ell Technologies， Exton， PA， USA)。 在欧洲， 自体成纤维细胞疗法被认为是 一种具有医院豁免的高级治疗药物产品(ATMP ‑HE)， 符合医药产品要求的药品自体小规模 非常规细胞治疗的生产不需要EMA(欧洲药品管理局)的集中上市许可。 目前研究表明， 成纤 维细胞具有极强的稳定性， 在培养中增殖后仍然保持其功 能特性。 自体成纤维细胞注射入 体内后不会形成肿瘤样生长或诱发肿瘤。 [0005]目前成纤维细胞常规培养方法分为消化法和组织块法。 消化法操作复杂， 组织需 求量大， 胰酶和胶原酶消化会对细胞造成极大损伤， 导致细胞增殖能力和活性降低， 培养成 纤维细胞纯度较低。 组织块法中组织块过大， 浪费组织并不利于细胞爬出。 此外 贴壁过程容 易干燥， 不易掌控组织块贴壁时间， 导致细胞尚未贴壁或干枯死亡。 此外常规培养过程， 成 纤维细胞培 养基中含有的胎牛 血清应用于细胞增殖培 养， 也会增免疫排斥等 风险。 [0006]成纤维细胞在体外培养随着时间， 其形态及细胞功能都会发生改变， 培养所需时 间越久细胞的转化就会愈加明显。 并且原代细胞培养时间长短， 极大程度影响细胞的增殖、 分泌细胞外基质的能力。 本方法极大程度增加组织利用率， 缩短培养时间， 提高培养效率。说　明　书 1/6 页 3 CN 115161273 A 3