(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211031355.8 (22)申请日 2022.08.26 (71)申请人 中国科学院上海微系统与信息技 术 研究所 地址 200050 上海市长 宁区长宁路865号 (72)发明人 冯世伦　黄亚茹　高则航　贾春平　 赵建龙　 (74)专利代理 机构 上海泰博知识产权代理有限 公司 31451 专利代理师 魏峯 (51)Int.Cl. C12M 1/34(2006.01) C12M 1/38(2006.01) C12M 1/00(2006.01) B01L 3/00(2006.01)C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01) (54)发明名称 一种集核酸提取纯化与数字化检测为一体 的多层微 流控芯片 (57)摘要 本发明涉及一种集核酸提取纯化与数字化 检测为一体的多层微流控芯片， 所述多层微流控 芯片由上至下包括PDMS基核酸提取纯化层 (100)、 玻璃基底(200)和硅基微腔数字PCR检测 层(300)。 本发明将样本制备及数字PCR检测集成 在一起， 能够应用于病原体的精准定量检测； 与 现有的病原体检测平台相比， 其在检测灵敏度、 流程自动化、 集成度等方面具有很大的优势， 在 分子诊断方面具有广阔的应用前 景。 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 CN 115491297 A 2022.12.20 CN 115491297 A 1.一种集核酸提取纯化与数字化检测为一体的多层微流控芯片， 其特征在于： 所述多 层微流控芯片由上至下包括PDMS基核酸提取纯化层(100)、 玻璃基底(200)和硅基微腔数字 PCR检测层(300)； 其中， 所述PDMS基核酸提取纯化层(100)由储液腔(110)、 底部连接管道 (101)、 微柱阵列(102)、 毛细爆 破阀(104)、 微腔检测层进样口连接孔(105)和微腔检测层出 样口连接孔(106)组成； 所述储液腔(110)包括依次通过底部连接管道(101)连接的裂解液 储液腔(111)、 第一洗涤液储液腔(112)、 第二洗涤液储液腔(113)、 矿物油储液腔(114)和洗 脱液储液腔(115)； 所述微柱阵列(102)用于矿物油储液腔(114)和洗脱液储液腔(115)的水 油相分离； 所述毛细爆破阀(104)用于阻止洗脱 液储液腔(115)中的液体在 核酸纯化过程中 自发进入微腔检测层进样口连接孔(10 5)。 2.根据权利 要求1所述的多层微流控芯片， 其特征在于： 所述裂解液储液腔(111)、 第一 洗涤液储液腔(112)、 第二洗涤液储液腔(113)利用油包水原理实现裂解液、 第一洗涤液和 第二洗涤液的互不干扰。 3.根据权利要求1所述的多层微流控芯片， 其特征在于： 所述玻璃基底(200)设有对应 微腔检测层进样口连接孔(10 5)和微腔检测层出样口连接孔(10 6)的开孔。 4.根据权利要求1所述的多层微流控芯片， 其特征在于： 所述硅基微腔数字PCR检测层 (300)包括微腔进样口(301)、 流道(302)、 微孔反应室(303)和出样孔(304)； 所述微腔进样 口(301)和微腔检测层进样口连接孔(105)相连， 所述出样孔(304)和微腔检测层出样口连 接孔(106)相连； 所述微孔反应室(303)通过流道(302)与微腔进样口(301)和出样孔(304) 相连。 5.根据权利要求1所述的多层微流控芯片， 其特征在于： 所述洗脱液储液腔(115)设有 洗脱液进样孔(10 3)。 6.一种如权利要求1所述的集核酸提取纯化与 数字化检测为一体的多层微流控芯片的 使用方法， 包括如下步骤： (1)首先将水性洗脱试剂预先填充到洗脱液储液腔(115)， 然后将矿物油注入到裂解液 储液腔(111)中并通过倾斜芯片使矿物油经底部连接管道(101)流经第一洗涤液储液腔 (112)、 第二洗涤液储液腔(113)、 矿物油储液腔(114)并填充； 再将核酸提取纯化试剂注入 对应的储液腔中， 各个试剂被分隔在独立的腔室内； (2)检测过程中， 将样品加入到裂解液储液腔(111)内， 样品中的细胞或病毒发生裂解， 释放的核酸分子被核酸提取磁珠(131)吸附， 然后拖动核酸提取磁珠(131)进入后续反应腔 室， 完成洗涤及洗脱过程， 得到PCR反应液； (3)胶带封闭除矿物油储液腔(114)以外的其它储液腔， 通过在矿物油储液腔(114)中 持续注入油相施加压力， 油相推着水相经微腔检测层进样口连接孔(105)有序进入硅基微 腔数字PCR检测层(300)； 最后将芯片放入原位PCR仪中并设定有关程序待反应完成后在荧 光显微镜下观察 其检测结果。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115491297 A 2一种集核酸提取纯化与数字化检测为一体的多层微流控芯片 技术领域 [0001]本发明属于病原体检测平台领域， 特别涉及一种集核酸提取纯化与数字化检测为 一体的多层微 流控芯片。 背景技术 [0002]核酸检测技术是近年来应用最为广泛的一种分子诊断技术， 在感染性疾病诊断中 此类技术可快速高效扩增病原菌的特征性核苷酸序列， 已在临床诊断、 疾病筛查等领域中 得到广泛应用。 传统的核酸检测步骤通常包括： 样本灭活、 核酸提取与纯化、 核酸扩增和 检 测等步骤。 其中核酸提取与纯化则是分子生物学实验中的关键， 其关系着能否提取出高质 量的核酸， 能够直接影响到后续试验的成败。 对于核酸提取纯化， 目前试剂盒提供的试剂常 常步骤繁琐需要耗费较长时间且易由于操作方式或实验环境引发交叉污染， 所以对医疗人 员的实验能力和检测环境有较高要求。 [0003]而核酸扩增和检测则是将提取纯化的病原菌特征性核苷酸序列进行高效快速扩 增并进行荧光或可视化检测， 以获得即时诊断结果。 核酸扩增方法的时长、 灵敏度及特异 性 也将直接影响后续结果的判读 。 目前核酸扩增检测常用的方法为 实时荧光定量P CR， 其可以 对样品中的核酸进行定性和定量分析， 为 目前核酸扩增检测的金标准。 但其缺点在于该方 法的定量分析必须依赖标准 曲线的存在， 无法实现核酸分子的绝对定量， 并且在核酸含量 低时无法检测低丰度的靶基因， 造成假阴性的结果。 [0004]针对上述现象， 已有研究将核酸提取纯化与灵敏度更高的数字化检测在芯片中集 成， 基于磁珠转移或驱动试剂流动分配实现检测流程的简化。 目前检测方式存在的不足常 为一体化集成检测难、 操作方式繁琐， 往往需要 借助负压或离心驱动液体流动。 因此集核酸 提取纯化与数字化检测一体化的高灵敏、 简易操作装置在分子诊断领域的应用还存在尚需 解决的问题。 发明内容 [0005]本发明所要解决的技术问题是现有技术一体化集成检测难、 操作方式繁琐、 需要 借助负压或离心驱动液体流动的问题。 [0006]本发明提供了一种集核酸提取纯化与数字化检测为一体的多层 微流控芯片， 所述 多层微流控芯片由上至下包括PDMS基核酸提取纯化层、 玻璃基底和 硅基微腔数字PCR检测 层； 其中， 所述PDMS基核酸提取纯化层由储液腔、 底部连接管道、 微柱阵列、 毛细爆破阀、 微 腔检测层进样口连接孔和微腔检测层出样口连接孔组成； 所述储液腔包括依次通过底部连 接管道连接的裂解液储液腔、 第一洗涤液储液腔、 第二洗涤液储液腔、 矿物油储 液腔和洗脱 液储液腔； 所述微柱阵列用于矿物油储液腔和洗脱液储液腔的水油相分离， 所述毛细爆破 阀用于阻止洗脱 液储液腔中的液体在核酸纯化过程中 自发进入进样口连接孔。 而只有在矿 物油储液腔中注入油相施加压力时， 水相才会突破毛细爆破阀经进样口连接孔进入硅基微 腔数字PCR检测层。说　明　书 1/5 页 3 CN 115491297 A 3