(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211109775.3 (22)申请日 2022.09.13 (71)申请人 宜昌东阳光长江药业股份有限公司 地址 443300 湖北省宜昌市宜都市滨江路 38号 (72)发明人 李爽　曾进　贾永峰　戴祖冰　 苏周　钟源　 (74)专利代理 机构 宜昌市三峡专利事务所 42103 专利代理师 王玉芳 (51)Int.Cl. C12M 1/38(2006.01) C12M 1/34(2006.01) C12M 1/04(2006.01) C12M 1/02(2006.01)C12M 1/00(2006.01) C12N 1/16(2006.01) C12R 1/84(2006.01) (54)发明名称 一种高耗氧、 高产热的毕赤酵母高密度发酵 工艺、 放大方法和发酵装置 (57)摘要 本发明涉及一种高耗氧、 高产热的毕赤酵母 高密度发酵工艺、 放大方法和发酵装置。 所述发 酵工艺包括： 将活化后的菌种接种至种子培养基 中； 将扩培后的菌种接种至发酵起始培养基中； 待溶氧值反弹时， 开始补加甘油溶液， 然后按梯 度流加策略调整甘油补加速率； 待达到一定菌浓 后， 停止补加甘油， 并开始补加甲醇溶液进行诱 导表达目标产物。 本发明以嗜甲醇毕赤酵母发酵 为对象， 进行了工艺上的优化， 并对生产规模的 发酵装置进行设计， 从而实现了发酵规模的放 大。 权利要求书2页 说明书8页 附图3页 CN 115521865 A 2022.12.27 CN 115521865 A 1.一种高密度发酵工艺中的酵母高密度培养设备， 其特征在于： 培养设备为发酵罐， 发 酵罐包括设有排气冷凝装置 （1） 、 搅拌装置 （2） 、 通气装置 （3） 、 冷却环形管 （5） 、 空气分布器 （9） 和罐体 （6） ； 搅拌装置 （2） 包括： 位于发酵罐内的搅拌轴 （7） ， 并由罐底的搅拌电机 （4） 驱 动， 搅拌轴 （7） 上设有搅拌桨组 （8） 。 2.根据权利要求1所述高密度发酵工艺中的酵母高密度培养设备， 其特征在于： 所述空 气分布器 （9） 为环形空气分布器； 均匀分布了若干个孔； 所述搅拌桨组 （8） 上的搅拌叶为轴 向混合斜叶浆和径向混合半圆桨交替布置； 搅拌桨组 （8） 为四组搅拌桨， 第一层和第三层桨 叶为斜叶桨， 第二层和第四层桨叶为半圆桨。 3.一种嗜甲醇 毕赤酵母的高密度发酵工艺， 其特 征在于， 所述发酵工艺包括如下步骤： （1） 菌种扩培： 将活化后的菌种接种至种子培养基中， 于28～32℃振荡培养10～14h后， 以0.5％～1.5％的体积比转接 到二级种子 培养基中， 于28～3 0℃振荡培 养20～24h； （2） 发酵培 养： ①起始生长阶段： 将扩培后的菌种接种至发酵起始培养基中， 接种浓度为2.0～6.0 × 105cfu/mL， 培养温度 控制在28～32℃， 通气比为1.0～1.5vvm； 调整搅拌转速控制溶氧值≥ 50％， 培养至14h左右该阶段 结束； ②甘油补加阶段： 发酵培养14h后开始补加甘油溶液， 按梯度流加策略调整甘油补加速 率， 使菌体活细胞 呈指数生长； 同时补入尿素溶液作为氮源， 控制温度为28～32℃， 通气比为1.0～1.5vvm， 培养至菌 体浓度OD600为150～300时停止补加甘油； ③甲醇诱导阶段： 停止补加甘油30～50min后， 开始补加甲醇溶液进行诱导， 设定不同 阶段的C/N （甲醇与尿素溶液质量比） 分别为： 诱导开始~70h为 （8‑12） :1， 70h~90h为 （14 ‑ 16） :1， 90h~120h为30:1， 12 0h~发酵结束 为 （14‑16） :1； 培养温度控制在2 5～28℃， 通气比为 1.5～2.5vvm， 培养140～180 h时结束。 4.根据权利要求3所述嗜甲醇毕赤酵母的高密度发酵工艺， 其特征在于， 所述步骤 （2） ： 起始生长阶段菌种接种至 培养基的接种量 为： 菌种的体积为发酵培 养基体积的1.0~5.0％。 5.根据权利要求3所述嗜甲醇毕赤酵母的高密度发酵工艺， 其特征在于， 所述步骤 （2） ： 发酵起始培养基中的组分包括： 甘油20～40g/L， 尿素5～8g/L， CaSO4·2H2O 0.4～1.0g/L， MgSO4·7H2O 5～8g/L， KOH  20～30g/L， H3PO4 20～30ml/L， PTM1溶液2～8ml/L， 消泡剂1～ 3ml/L。 6.根据权利要求5所述嗜甲醇毕赤酵母的高密度发酵工艺， 其特征在于， 所述PTM1溶液 的组成为： CuSO4·5H2O 6g/L， KI 0.08g/L， MnSO4·H2O 3g/L， Na2MoO4·2H2O 0.2g/L， H3BO3  0.02g/L， ZnSO4·7H2O 20g/L， FeSO4·7H2O 65g/L， CoCl2·6H2O 0.5g/L， H2SO4 5ml/L， Biotin 0.2g/L。 7.根据权利要求3所述嗜甲醇毕赤酵母的高密度发酵工艺， 所述步骤 （2） ： 尿素溶液的 组成为： 0.2~0.6g/L的尿素 溶液。 8.根据权利要求3所述 嗜甲醇毕赤酵母的高密度发酵工艺， 其特征在于： 所述 ②甘油补 加阶段： 培养至14h后开始补加甘油溶液， 以8～12  L/h/m3的初始速率补加甘油溶液， 甘油 溶液的组成为： 0.3~0.7g/L的甘油溶 液； 所述步骤 （2） 中 ②甘油补加阶段： 甘油补加速率为： 甘油补加速率为： 0 ‑14h期间不补加权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115521865 A 2甘油， 14‑15h设置速率为8‑12 L/h/m3， 之后每小时提速率2 ‑4 L/h/m3， 直至甘油补加结束。 9.根据权利要求3所述 嗜甲醇毕赤酵母的高密度发酵工艺， 其特征在于： 所述 ③甲醇诱 导阶段： 甲醇溶 液是将8‑14mL PTM1溶于1L甲醇溶 液中配制而成。 10.根据权利要求3所述嗜甲醇毕赤酵母的高密度发酵工艺， 其特征在于： 所述 ③甲醇 诱导阶段： 补加甲醇溶 液后先降温至25 ‑28℃培养80‑100h后， 再降温至25℃。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115521865 A 3