ICS 01.120 CCS A 000 安 34 4 徽 省 地 方 标 准 DBB34/T 386 61—2021 畜禽 禽血清 清中黄 黄曲霉 霉毒素 素 B1 生物标 生 标志物 物的测 测 定 高 高效液 液相色谱法 Determinnation of AFB A 1 biom marker in serum high h perfoormance liquid chrom matograph hic method d 2021-001-25 发布 布 -02-25 实施 实 2021- 安徽省市场 安 场监督管理 理局 发 布 DB34/T 3861—2021 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由安徽农业大学提出。 本文件由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：安徽农业大学、安徽浩翔农牧有限公司（农业农村部猪肉质量安全控制重点实验 室）、望江县小月山农业发展有限公司、和县农业农村局、望江县畜牧兽医局、安徽省动物疫病预防与 控制中心、安徽省农业科学院畜牧兽医研究所、宿松县春润食品有限公司。 本文件主要起草人：王希春、杨长根、陈祥国、赵家喜、沈艳、高亚飞、王军、汤继顺、赵杰、吴 金节、李玉、冯士彬、孙裴、涂健、冯江华。 I DB34/T 3861—2021 畜禽血清中黄曲霉毒素 B1 生物标志物的测定 高效液相色谱法 1 范围 本文件确立了畜禽血清中黄曲霉毒素B1 生物标志物含量的高效液相色谱法测定方法，并规定了测定 原理、试剂和设备、测定步骤、测定结果的表述、重复性、检出限与定量限、回收率。 本文件适用于畜禽血清中 AFB1 生物标志物的测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 黄曲霉毒素 B1 Aflatoxin B1，AFB1 主要由黄曲霉与寄生曲霉代谢产生的一种真菌毒素，进入体内以后会与血液白蛋白中的赖氨酸 （Lysine）结合形成稳定的生物标志物 AFB1-Lysine。 4 原理 通过蛋白酶的消化，从血清白蛋白中释放出 AFB1 生物标志物，采用固相萃取柱浓缩。浓缩的 AFB1 生物标志物经高效液相色谱仪分离，用荧光检测器检测。 5 试剂和设备 5.1 5.1.1 5.1.2 5.1.3 5.1.4 5.1.5 5.1.6 5.1.7 5.1.8 5.1.9 试剂与材料 甲醇（CH3OH）：色谱纯。 蛋白酶。 磷酸二氢铵（NH4H2PO4），分析纯。 叠氮化钠（NaN3），分析纯。 白蛋白试剂（DMA）：生物试剂。 蛋白检测染料试剂浓缩液（考马斯亮蓝 G-250） 氯化钠（NaCl），分析纯。 磷酸氢二钠（Na2HPO4），分析纯。 磷酸二氢钾（KH2PO4），分析纯。 1 DB34/T 3861—2021 5.1.10 5.1.11 5.1.12 5.1.13 5.2 仪器与设备 5.2.1 5.2.2 5.2.3 5.2.4 5.2.5 5.2.6 5.2.7 5.2.8 5.2.9 5.2.10 5.2.11 6 氢氧化铵（NH4OH），分析纯。 甲酸（HCOOH），分析纯。 AFB1 生物标志物标准品 AFB1-Lysine（纯度≥99％）。 除另外说明外，本标准所用试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 的一级水。 高效液相色谱仪（含荧光检测器、柱温箱）。 水浴恒温摇床。 固相萃取柱（1 cc/30 mg）。 粒径 5 µm C18 高效液相色谱柱（Ø250 × 4.6 mm）。 涡旋振荡器。 微量进样器。 天平（感量 0.0001 g）。 pH 计。 -80℃超低温冰箱。 冷冻离心机：转速≥3500 g。 紫外分光光度计。 测定步骤 6.1 样品制备 无菌采集新鲜血液 5 mL，室温静置 2 h，2000 g 离心 15 min，取上清液转移至另一离心管中。 6.2 总蛋白及白蛋白含量测定 6.2.1 6.2.1.1 血清总蛋白浓度测定 4℃下精密称取 1 mg/mL 蛋白标准品置于玻璃管中用于制备标准曲线，各管添加量见表 1。 表1 血清总蛋白标准曲线绘制 标准溶液 水 标准 (μL) (μL) (μg) 1 0 800 0 2 2 798 2 3 4 796 4 4 6 794 6 5 8 792 8 6 10 790 10 7 15 785 15 序号 6.2.1.2 取待测血清 5 μL 至离心管中，加入 95 μL 水稀释样品，涡旋混合均匀，然后将 4 μL 稀 释样品转移到预先添加 796 μL 水的玻璃试管中；向所有管中加入 200 μL 考马斯亮蓝 G-250，室温 下涡旋，混合均匀转移至待测试管中；以试管 1 作为空白，在 595 nm 的波长下，使用紫外分光光度 2 DB34/T 3861—2021 计进行测量；记录标准品和样品的吸光度读数，根据标准吸光度制作标准曲线，由公式计算可得总蛋白 浓度。 6.2.1.3 血清总蛋白含量计算公式见公式（1）、公式（2）、公式（3）： 标准曲线： y ax b ·········································································· (1) X (A - b) a 150 μL 血清总蛋白浓度 C ······································································ (2) X × 20 × 250 × 150 1000 ···································· (3) 式中：  X ——待测血清中总蛋白含量（μg）； A ——待测血清吸光度读数； a ——标准曲线斜率； b ——标准曲线截距。 6.2.2 6.2.2.1 血清白蛋白含量测定 4℃下取 4 g/dL 蛋白标准品溶液置于玻璃管中用于制备标准曲线，各管添加量见表 2。 表2 血清白蛋白标准曲线制备 标准品溶液 水 标准品 (μL) (μL) (μg) 1 0 20 0 2 2.5 17.5 100 3 5 15 200 4 7.5 12.5 300 5 10 10 400 6 15 5 600 7 20 0 800 序号 6.2.2.2 取待测血清 10 μL 置于一个单独的玻璃试管，并在管内加 10 μL 水；向所有管中加入 1 mL DMA， 室温下涡旋；混合均匀转移至待测试管中，以试管 1 作为空白，在 630 nm 的波长下，使用紫外分光光 度计进行测量；记录标准品和待测血清的吸光度读数，根据标准吸光度制作标准曲线，由公式计算可得 血清白蛋白含量。 6.2.2.3 150 μL 血清白蛋白计算公式见公式（4）、公式（5）、公式（6）： 标准曲线： y ax b ·········································································· (4) X (A - b) a ······································································ (5) 3 DB34/T 3861—2021 150 μL 血清白蛋白浓度 X 10 150 μL ················································· (6) 式中：  X ——10 μL 待测血清中白蛋白含量（μg）； A ——待测血清吸光度读数； a ——标准曲线斜率； b ——标准曲线截距。 6.3 蛋白质消化 在离心管中添加 150 μL 血清和 10 mg/mL 蛋白酶（附录 A.1.7），血清与蛋白酶比例为 1:4，酶 C 需要量为血清总蛋白含量 1000 × 4 ×10 （mL），37℃水浴摇床中孵育 3 h，确保水位达到标准线，样品在 摇床上消化 3 h。 6.4 待测样本纯化 加入 1 mL 水、1 mL 甲醇激活平衡固相萃取柱，自然流出，依次加入待测血清，1.0 mL/min 的流 速顺序分两次各加入 1 mL 水洗涤、1 mL甲醇-水溶液（附录 A.1.4）和氢氧化铵（附录 A.1.8）洗涤， 在 0.5 mL 甲醇中洗脱后干燥，用 1 mL 甲酸-水溶液（附录 A.1.5）洗脱纯化两次，收集洗脱液，干 燥 55 min。向所得干燥物中加入 150 μL 甲醇-水溶液（附录 A.1.3），涡旋 5 min，3500 g 离心 5 min， 在 2 min 内进样分析。 6.5 仪器设定条件 6.5.1 6.5.2 6.5.3 表 3。 6.5.4 6.5.5 6.5.6 色谱柱：C18 柱，Ø250 mm×4.6 mm，5 μm 或相当者。 检测波长：激发波长 405 nm，发射波长 470 nm。 流动相：A 相:磷酸二氢铵（附录 A.1.1）（含叠氮化钠）；B 相:甲醇。梯度洗脱，洗脱程序见 流速：1.0 mL/min。 柱温：25℃。 进样量：150 μL。 表3 6.6 6.6.1 4 流动相洗脱程序 时间 流动相 A 流动相 B min ％ ％ 0 30 70 5 30 70 15 65 35 18 65 35 20 30 70 试样溶液的测定 在 6.5 色谱条件下，将 150.0 μL AFB1 生物标志物标准工作溶液（附录 A.2.2）按浓度从低到 DB34/T 3861—2021 高依次注入高效液相色谱仪，AFB1 生物标志物标准品色谱图参考附录 B；待仪器条件稳定后，以目标物 质的浓度为横坐标（x 轴），目标物质的峰面积为纵坐标（y 轴），对各个数据点进行最小二乘线性拟 合，标准曲线见公式（7）： y ax b ··························································