ICS 65.020.30 CCS B40 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2148—2021 规模化羊场绒山羊舍饲管理技术规程 气相色谱-质谱法 Determination of actanol content in ruminant feces by using gas chromatography-mass spectrometry technique 2021-04-15 发布 2021-05-15 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 2148—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。 本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、伊金霍洛旗文兵农业机械服务企业。 本文件主要起草人：孙海洲、张春华、李胜利、桑丹、张崇志、金鹿、伶俐、刘和平、王泽平、赵 晓华、王永荣、刘要仙、韩文兵、敖特更达赖。 I DB15/T 2148—2021 反刍动物粪中阿克醇的测定 气相色谱-质谱法 1 范围 本文件规定了反刍动物粪中阿克醇的测定 气相色谱-质谱法。 本文件适用于反刍动物粪中阿克醇的测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 3358.1 统计学词汇及符号 第1部分：一般统计术语与用于概率的术语 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 古细菌 archaea 生活于热泉水、缺氧湖底、盐水湖等极端环境中的一种细菌。它具有一些独特的生化性质，如膜脂 由醚键而不是酯键连接。其营养方式亦不同于常规生物，如硫氧化等。 注：包括3类不同的细菌：产甲烷细菌、极端嗜盐细菌和嗜酸嗜热细菌，已知的瘤胃古细菌绝大部分为产甲烷古细 菌。 3.2 阿克醇 archaeol 产 甲 烷 古 细 菌 脂 膜 的 基 本 结 构 成 分 之 一 ， 化 学 结 构 为 1, 2- 双 植 烷 甘 油 （2,3diphytany1-0-sn-glycerol） 。 4 试剂和材料 4.1 磷酸二氢钾，分析纯。 4.2 氢氧化钾，分析纯。 4.3 盐酸，分析纯。 4.4 二氯甲烷。 4.5 甲醇，99.9 %。 1 DB15/T 2148—2021 4.6 氯仿，99.9 %。 4.7 三甲基氯硅烷，99.9 %。 4.8 N,O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺，99.9 %。 4.9 乙酸乙酯，色谱级，99.9 %。 4.10 内标，1,2-双二十六烷基甘油，99.99 %。 4.11 古细菌膜脂标准品，1,2-双植烷酸甘油， 99.99 %。 4.12 水：水用二氯甲烷（DCM）处理三次后使用。 4.13 硅胶柱，0.5 g 硅胶，60×10-10 m 粒度，125 ℃活化 2 h，冷却至室温，立即转移到玻璃柱中。 4.14 单相溶剂，缓冲液、甲醇和氯仿按 4:10:5 的体积比配制而成。 4.15 缓冲液，0.05 M 磷酸二氢钾溶液（6.8 g 磷酸二氢钾溶于 1000 mL 水溶液），用氢氧化钾调为 pH7.2。 4.16 5 % 盐酸甲醇溶液，盐酸和甲醇 1：20 比例混合。 5 仪器和设备 5.1 气相色谱-质谱联用仪，配有电子轰击源（EI 源）。 5.2 分析天平，感量 0.0001 g。 5.3 超声仪。 5.4 离心机。 5.5 旋涡混匀器。 5.6 旋转蒸发仪。 5.7 水浴锅。 6 样品处理 采集反刍动物新鲜粪便10 g，于65 ℃烘干72 h，研磨后，过0.8 mm筛备用。 7 测定步骤 7.1 样品的提取 将43.4 μg内标1,2-双二十六烷基甘油，加入到300 mg干燥研磨后的粪样中（三份平行样），采 用单相提取方法提取全脂，并用50 mL二氯甲烷分三次提取。加入2 mL单相溶剂（4.14）至粪样中，超 声处理15 min后，置于1500 r/min离心机离心5 min，收集含有脂质的上清液。沉淀部分重复上述操作， 共提取三次。合并上清液，加入2 mL缓冲液（4.15）与2 mL氯仿后旋涡混匀，1500 r/min离心5 min。 2 DB15/T 2148—2021 收集有机相（底层），上层为水相，用2 mL氯仿冲洗水相2次，合并提取物，转至旋转蒸发仪，用氮气 旋转蒸发干燥，获得总脂。 7.2 甲酯化 获得的总脂中加入5 mL的5 %盐酸甲醇（4.16），于密封管中100 ℃加热3 h。取出冷却后，加入2 mL双蒸水和2 mL氯仿（4.6），产生有机相和水溶相。收集有机层（底层），水溶相用氯仿冲洗两次。 合并提取物，用氮气蒸发干燥。 7.3 净化 使用一个活化硅胶柱（4.13）进行分离。玻璃柱预先用二氯甲烷处理（2倍柱容，柱容：100 mL）， 总脂混合物加入柱内时也使用同一溶剂。非极性部分用二氯甲烷（3倍柱容，柱容：150 mL）洗涤，接 着醇部分用150 mL二氯甲烷:甲醇(1:1体积比，3倍柱容，柱容：150 mL）洗涤3次。溶剂用N2气流蒸发 干燥。 7.4 衍生化 醇部分加入50 μL含1 % 三甲基氯硅烷的N,O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA+1 %TCMS） 中进行衍生化，70 ℃加热1 h。接着BSTFA在N2气流中蒸发干燥。样品溶解于5 mL的乙酸乙酯中，待测 定。 7.5 阿克醇定量分析 7.5.1 色谱条件 阿克醇定量分析的色谱条件设定如下： a) 色谱柱：非极性固定相硅胶色谱柱（ZB-1，60 m×0.32 mm×0.1 μm 相同功效的色谱柱）； b) 色谱柱温度程序：柱起始温度 70 ℃，以 20 ℃/min 升温至 130 ℃，然后以 2 ℃/min 升温至 300 ℃； c) 载气：高纯氮气； d) 进样口温度：300 ℃； e) 进样量：1 μL； f) 电子轰击源 ：70 ev； g) 离子源温度：250 ℃； h) GC-MS 接口温度：250 ℃； i) 选择离子监测：特征离子为 m/z 130，278，284，426。 7.5.2 标准曲线的制作 通过加入100 ng/μL的内标(4.10)，与古细菌膜脂标准品（4.11）5，25，50，150及250 ng/μL， 利用GC-MS制作校准曲线。测定内标和膜脂标准品的峰面积Astd和Ax。以浓度和峰面积制作标准曲线。 7.6 平行试验 按以上步骤对同一试样进行平行测定。 7.7 空白试验 除不称取试样外，均按上述测定步骤进行。 3 DB15/T 2148—2021 8 结果计算和表述 取两次测定结果的算数平均值作为结果，计算结果保留一位小数。 9 重复性 每试样称取两个平行样进行测定，取平均值为测定结果。 根据GB/T 3358.1，在重复条件下同一样品获得的测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10 %。 4 DB15/T 2148—2021 附 录 A （资料性） 阿克醇测定质谱图 阿克醇测定质谱图见图A.1。 图A.1 阿克醇测定质谱图 5