(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210520001.3 (22)申请日 2022.05.13 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114686407 A (43)申请公布日 2022.07.01 (83)生物保 藏信息 CGMCC No.1.1273 5 2020.07.20 (73)专利权人 微康益生菌 （苏州)股份有限公司 地址 215200 江苏省苏州市吴江经济技 术 开发区龙桥路10 33号 (72)发明人 方曙光　严涛　陈珂可　冯胜鹏　 朱建国　程文　蒋大成　 (74)专利代理 机构 北京品源专利代理有限公司 11332 专利代理师 边人洲(51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 1/38(2006.01) C12N 1/04(2006.01) C12R 1/23(2006.01) (56)对比文件 CN 109749 964 A,2019.0 5.14 CN 10232 9759 A,2012.01.25 CN 113755370 A,2021.12.07 CN 106701912 A,2017.0 5.24 CN 112694976 A,2021.04.23 CN 108559717 A,2018.09.21 审查员 郭雅萍 (54)发明名称 一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌 粉的制备方法 (57)摘要 本发明提供一种提高可培养细胞含量的嗜 酸乳杆菌菌粉的制备方法。 所述制备方法包括以 下步骤： （1） 将嗜酸乳 杆菌在MRS琼脂培养基上进 行划线分离培养， 至所述MRS琼脂培养基中出现 直径至少为3 ‑5 mm的菌落； （2） 培养得到的菌落 接种于MRS液体培养基中进行梯度发酵培养， 结 束培养后再向MRS液体培养基中混合渗透压调节 剂和/或酶类物质， 收集， 得到菌体； （3） 将菌体与 保护剂混合， 进行静电干燥， 得到嗜酸乳杆菌菌 粉。 本发明通过对嗜酸乳杆菌菌株及生产工艺改 善， 保证菌粉初始活菌 数的同时降低菌粉中VBNC 状态的菌体数量， 提升可培养菌体活菌数数量及 占比， 降低了 工业化生产的成本 。 权利要求书1页 说明书9页 CN 114686407 B 2022.09.06 CN 114686407 B 1.一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌( Lactobacillus  acidophilus ) 菌粉的制 备方法， 其特 征在于， 所述制备 方法包括以下步骤： （1） 将嗜酸乳杆菌在MRS琼脂培养基上进行划线分离培养， 至所述MRS琼脂培养基中出 现直径至少为 4‑5 mm的菌落； （2） 将步骤 （1） 培养得到的菌落接种于MRS液体培养基中进行梯度发酵培养， 结束培养 后再向MRS液体培 养基中混合 渗透压调节剂和酶类物质， 收集， 得到 菌体； 所述梯度发酵培养的程序为： 在36 ‑38℃下发酵培养2 ‑2.5 h， 再将温度降至34 ‑36℃发 酵培养4‑4.5 h， 再将温度降至31 ‑33℃发酵培养6 ‑6.5 h， 再将温度降至29 ‑31℃发酵培养 8‑8.5 h， 最后将温度降至27 ‑29℃结束培 养； （3） 将步骤 （2） 得到的菌体与保护剂混合， 进行静电干燥， 得到嗜酸乳杆菌 菌粉； 步骤 （1） 中， 所述嗜酸乳杆菌为嗜酸乳杆菌 Lactobacillus  acidophilus  LA85菌株， 保 藏编号为CGMCC No.1.1273 5， 保藏日期为2020年07月20日； 步骤 （2） 中， 所述梯度发酵培 养的过程需控制发酵 液pH为5.0 ‑5.8； 步骤 （2） 中， 所述渗透压调节剂的添加量占所述MRS液体培养基 的0.2 wt%； 其中， 所述 渗透压调节剂为四氢嘧啶； 所述酶类物质的添加量占所述MRS液体培养基的0.1 ‑0.5 wt%； 其中， 所述酶类物质为过 氧化氢酶。 2.根据权利要求1所述的提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法， 其特征 在于， 步骤 （1） 中， 所述分离 培养的温度为3 6‑38℃， 所述分离 培养的时间为 48‑72 h。 3.根据权利要求1所述的提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法， 其特征 在于， 步骤 （2） 中， 所述控制发酵 液pH的物质为碱性混合物。 4.根据权利要求3所述的提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法， 其特征 在于， 所述碱性混合物选自氨水和碳酸钠的混合物、 氢氧化钠和碳酸钠的混合物、 氢氧化钠 和氨水的混合物、 硝酸钠和氨水的混合物、 硝酸钠和氢氧化钠的混合物、 硝酸钠和碳酸钠的 混合物中的任意 一种或至少两种的组合。 5.根据权利要求1所述的提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法， 其特征 在于， 步骤 （3） 中， 所述菌体与保护剂的质量比为(1 ‑2):(1‑3)； 其中， 所述保护剂按质量百分含量计 由如下组分组成： 海藻糖10 ‑30%、 蔗糖0.5 ‑5%、 甘 油0.5‑3%， 余量为水。 6.根据权利要求1所述的提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法， 其特征 在于， 步骤 （3） 中， 所述静电干燥采用喷嘴式喷雾干燥器进行， 具体条件为： 进风温度为40 ‑ 60℃， 进风流量为15 ‑25 Nm3/h， 出风温度为20 ‑30℃， 雾化温度为30 ‑46℃， 雾化压力为100 ‑ 350 kPa， 静电 电压为1‑30 kV。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114686407 B 2一种提高 可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌 菌粉的制备方 法 技术领域 [0001]本发明属于微生物技术领域， 尤其涉及一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌 粉的制备 方法。 背景技术 [0002]对不可培养微生物的培养及其机制的研究一直是微生物领域的研究热点和难点。 活的但非可培养( viable but non‑culturable ， VBNC)是指处于代谢活性非常低的状态并 且不分裂、 但一旦被复苏就具有存活能力并且能够变得可培养的细菌。 有生理活性的细菌 数， 包括可培养的活菌数和VBNC状态的菌体数。 VBNC生理状态广泛存在于已培养和未可培 养的微生物中。 [0003]乳酸菌在一定的条件下 （低温、 营养物质影响、 pH值变化、 底物浓度影响、 渗透压变 化等） ， 也可以形成VBNC的生理状态， 这种状态下的乳酸菌， 仍具有其生理活性， 但是在 普通 的常规培养基上很难检测出来， 因此会影响最终乳酸菌在活菌计数平板 （GB4789.35） 上的 检测结果。 [0004]目前， 有很多文献报道主要采用各种方法来诱导产生VBNC的状态， 如采用物理胁 迫因素和化学诱导因素两大类诱导细菌进入VBNC状态； 还有就是将得到的乳酸菌菌粉采用 外界干预手段对其进行复苏， 但是没有提到从如何在生产乳酸菌的工艺角度上， 降低 或者 减少VBNC菌体的数量， 提升可培养的乳酸菌数量。 而活菌数是目前乳酸菌菌粉的质量评价 关键指标， 其检测的高低， 直接影响了菌粉的使用 （添加量） 及企业成本， 而且其检测方法都 是标准化的国标， 不能在检测方法上进行 更改。 [0005]CN109749964A提供了一种提高嗜酸乳杆菌 发酵与冻干活菌数的培养基处理方法。 本发明同现有技术相比， 根据嗜酸乳杆菌营养需求， 在添加有机豌豆蛋白粉增菌试验的基 础上， 减少发酵液离心、 乳化、 冻干后的杂质， 以提高嗜酸乳杆菌冻干菌粉的活菌数。 但该方 法还是较为容易因培养基原因造成的VBNC状态菌体的产生， 且发酵液中渗透压及代谢产 物 过氧化氢过高对菌体形成VBNC的影响， 发酵与冻干活菌数仍有 待提高。 [0006]CN112694976A提供了一种高活菌数嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法， 所述制备方法 为： 将嗜酸乳杆菌接种到以乳酸为碳源、 酵母粉、 蛋白胨和牛肝浸粉为组合氮源的高密度发 酵培养基中在温度30 ‑37℃、 转速60 ‑150 rpm、 初始pH  6.2‑6.5的条件下发酵 10‑12 h， 发酵 过程中用碳酸钠溶液控制pH  5.5‑6.0， 维持罐压0.03  Mpa； 得到的发酵液离心去上清后收 集菌泥， 菌泥与冻干保护剂按质量比1:1 ‑1.2混匀， 真空冷冻干燥得到嗜酸乳杆菌冻干菌 粉。 该方法通过对培养基营养成分的调整来达到提高嗜酸乳杆菌冻干菌粉的活菌数， 但难 以避免的仍存在培养基原因造成的VBNC状态菌体的产生、 发酵速度过快造成的代谢产 物抑 制对菌体造成反馈影响形成VBNC状态等问题。 [0007]因此， 如何更好的将乳酸菌菌粉中的可培养的活菌数提升， 降低VBNC状态的菌体 数量， 提升 菌粉的检测活菌数， 已成为亟 待解决的问题。说　明　书 1/9 页 3 CN 114686407 B 3